[论文解读] Illumina Sequencing Artifacts Revealed by Connectivity Analysis of Metagenomic Datasets

Adina Chuang Howe, Jason Pell+6 more|arXiv (Cornell University)|Dec 1, 2012

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 28被引用 7

一句话总结

本研究通过 de Bruijn 图的连通性分析，在 Illumina 代谢组测序数据中识别出普遍存在的序列构建伪影，揭示了由位置特异性偏差引起的高度连接的‘团块’状读段。去除这些易产生伪影的序列可提高组装准确性，降低内存使用量，并实现高效的并行处理，经过滤的组装结果在多种代谢组中表现出一致的内容。

ABSTRACT

Sequencing errors and biases in metagenomic datasets affect coverage-based assemblies and are often ignored during analysis. Here, we analyze read connectivity in metagenomes and identify the presence of problematic and likely a-biological connectivity within metagenome assembly graphs. Specifically, we identify highly connected sequences which join a large proportion of reads within each real metagenome. These sequences show position-specific bias in shotgun reads, suggestive of sequencing artifacts, and are only minimally incorporated into contigs by assembly. The removal of these sequences prior to assembly results in similar assembly content for most metagenomes and enables the use of graph partitioning to decrease assembly memory and time requirements.

研究动机与目标

• 调查由测序伪影引起的代谢组组装图中的人工连通性存在性。
• 识别出并非源自生物来源、而是由平台特异性偏差导致的高度连接的 k-mer 序列。
• 评估去除这些伪影序列对从头代谢组组装性能与效率的影响。
• 通过伪影去除后的数据集划分，实现更准确且可扩展的代谢组组装。
• 提供一种检测和过滤干扰覆盖度估计与连续片段构建的测序伪影的方法。

提出的方法

• 使用 k=32 的 k-mer 长度，从 Illumina 代谢组测序数据构建 de Bruijn 图，以分析读段连通性。
• 将‘团块’定义为每个组装图中最大的连通分量，将其识别为异常高连通性的区域。
• 计算每个 k-mer 周围的局部图密度以量化连通性，密度值 >20 表示高度非线性、过度连接的区域。
• 分析读段序列中图密度的位置特异性变化，发现所有环境代谢组中高密度区域在 3’-末端均存在一致富集。
• 通过 Bowtie 和 blastn 将高度连接的高丰度 k-mer 与参考基因组及 NCBI 非冗余数据库进行比对，以识别完全匹配。
• 在重新组装前从读段中过滤掉伪影 k-mers，使用 Velvet 和 Meta-IDBA 进行组装，并比较未过滤与已过滤组装结果。

实验结果

研究问题

• RQ1 代谢组组装图中异常高连通性的原因是什么？其是否具有生物学意义？
• RQ2 测序伪影如何在读段连通性中表现为位置特异性偏差？
• RQ3 高度连接的 k-mers 在多大程度上导致组装错误和内存开销？
• RQ4 去除这些伪影序列是否能提高从头代谢组组装的准确性和效率？
• RQ5 过滤伪影 k-mers 是否能导致在多种不同代谢组中产生一致且更可靠的组装内容？

主要发现

• 在人类肠道代谢组中，团块包含了所有读段的 75%，而模拟代谢组中仅占 5%，表明真实数据中伪影普遍存在。
• 在所有真实代谢组中，团块内 22–50% 的节点具有 >20 的局部图密度，而模拟数据中仅占 17%，表明存在非生物来源的过度连接。
• 位置特异性分析显示，所有环境代谢组中读段 3’-末端的图密度显著更高，提示平台特异性测序偏差。
• 高度连接的 k-mers 被证实为非生物来源，人类肠道中前 100 个最丰富的 32-mer 中有 95% 与任何参考基因组或 NCBI 数据库均不匹配。
• 去除伪影 k-mers 后，过滤后的组装在不同数据集中表现出相似的内容，表明偏差减少且结果更一致。
• 过滤后的组装所需内存和时间更少，且由于连通性降低，图划分成为可能，从而实现了并行处理。