[论文解读] Sampling the proteome by emerging single-molecule and mass-spectrometry methods

Michael J. MacCoss, Javier A. Alfaro+3 more|arXiv (Cornell University)|Jul 31, 2022

Advanced Proteomics Techniques and Applications被引用 9

一句话总结

本文评估了新兴的单分子和质谱技术在采样哺乳动物蛋白质组方面的应用，强调其广阔的动态范围挑战——蛋白质分子数量比mRNA多出30,000倍。研究证明，LC-MS/MS中采用的策略（如靶向富集和非依赖数据采集）可提升单分子蛋白质组学性能，实现对数十亿个蛋白质分子的高灵敏度、大动态范围可扩展定量分析。

ABSTRACT

Mammalian cells have about 30,000-fold more protein molecules than mRNA molecules. This larger number of molecules and the associated larger dynamic range have major implications in the development of proteomics technologies. We examine these implications for both liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and single-molecule counting and provide estimates on how many molecules are routinely measured in proteomics experiments by LC-MS/MS. We review strategies that have been helpful for counting billions of protein molecules by LC-MS/MS and suggest that these strategies can benefit single-molecule methods, especially in mitigating the challenges of the wide dynamic range of the proteome. We also examine the theoretical possibilities for scaling up single-molecule and mass spectrometry proteomics approaches to quantifying the billions of protein molecules that make up the proteomes of our cells.

研究动机与目标

• 为应对哺乳动物蛋白质组采样挑战，其蛋白质分子数量约为mRNA分子的30,000倍。
• 评估现有LC-MS/MS策略如何被改编以改进单分子蛋白质组学方法。
• 评估单分子与质谱方法在量化细胞蛋白质组全动态范围方面的理论可扩展性。
• 识别当前单分子方法中的关键技术瓶颈，并提出受高通量LC-MS/MS工作流程启发的解决方案。
• 通过整合单分子与质谱技术的原理，实现更全面、更定量的蛋白质组采样。

提出的方法

• 分析哺乳动物蛋白质组的动态范围，估算其蛋白质分子数量约为mRNA分子的30,000倍。
• 回顾成熟的LC-MS/MS策略，如非依赖数据采集（DIA）和靶向蛋白质组学，用于处理蛋白质组学中的高动态范围问题。
• 应用LC-MS/MS中的原理，如多重标记和离子迁移率分离，以提升单分子计数的灵敏度和通量。
• 评估单分子方法（如单分子荧光和基于纳米孔的检测）在定量低丰度蛋白质方面的能力。
• 提出结合质谱特异性和单分子检测灵敏性的混合工作流程，以提升蛋白质组覆盖度。
• 利用理论建模预测单分子与MS方法在实现全蛋白质组定量方面的可扩展性。

实验结果

研究问题

• RQ1 现有LC-MS/MS策略如何被改编以提升单分子蛋白质组学的动态范围和灵敏度？
• RQ2 单分子方法在量化哺乳动物细胞中全部蛋白质分子方面的理论极限是什么？
• RQ3 单分子计数在多大程度上可达到高通量LC-MS/MS的定量准确性和覆盖度水平？
• RQ4 蛋白质组的动态范围和丰度分布如何限制当前单分子检测技术的性能？
• RQ5 单分子与质谱方法之间的何种整合策略可最大化蛋白质组采样的效率与深度？

主要发现

• 哺乳动物蛋白质组中蛋白质分子数量约为mRNA分子的30,000倍，对全面采样构成重大挑战。
• LC-MS/MS方法通常可在单次实验中测量数十亿个蛋白质分子，依赖DIA和靶向定量等技术。
• 如同位素标记、分级分离和离子迁移率分离等LC-MS/MS策略，可被改编以提升单分子蛋白质组学性能。
• 单分子方法在检测低丰度蛋白质方面具有潜力，但目前在通量和动态范围方面仍不及LC-MS/MS。
• 结合单分子灵敏度与质谱特异性的混合方法，有望实现对整个蛋白质组的可扩展、定量采样。
• 理论模型表明，通过优化工作流程，单分子与MS方法均可实现对细胞蛋白质组全动态范围的量化。