[论文解读] Single-molecule imaging of DNA gyrase activity in living Escherichia coli

Mathew Stracy, Adam J. M. Wollman+10 more|PubMed|Nov 1, 2018

Advanced biosensing and bioanalysis techniques参考文献 15被引用 5

一句话总结

本研究利用活体大肠杆菌中的高速单分子荧光成像技术，实时可视化了DNA旋转酶的动力学，发现约300个旋转酶分子稳定结合于染色体DNA，其中约12个富集于复制叉附近。研究显示，分散的旋转酶分子停留约2秒以维持负超螺旋，而靠近复制体的酶停留约8秒，表明其对复制叉前方正超螺旋的持续性松弛。

ABSTRACT

Bacterial DNA gyrase introduces negative supercoils into chromosomal DNA and relaxes positive supercoils introduced by replication and transiently by transcription. Removal of these positive supercoils is essential for replication fork progression and for the overall unlinking of the two duplex DNA strands, as well as for ongoing transcription. To address how gyrase copes with these topological challenges, we used high-speed single-molecule fluorescence imaging in live Escherichia coli cells. We demonstrate that at least 300 gyrase molecules are stably bound to the chromosome at any time, with ∼12 enzymes enriched near each replication fork. Trapping of reaction intermediates with ciprofloxacin revealed complexes undergoing catalysis. Dwell times of ∼2 s were observed for the dispersed gyrase molecules, which we propose maintain steady-state levels of negative supercoiling of the chromosome. In contrast, the dwell time of replisome-proximal molecules was ∼8 s, consistent with these catalyzing processive positive supercoil relaxation in front of the progressing replisome.

研究动机与目标

• 为了理解DNA旋转酶在活细胞中应对DNA复制和转录过程中的拓扑挑战的机制。
• 为了在完整的大肠杆菌细胞中实时可视化旋转酶活性的时空动态。
• 为了根据旋转酶分子相对于复制体的亚细胞定位，确定其功能特化。
• 为了量化旋转酶的停留时间，并评估其在维持染色体超螺旋稳态中的作用。

提出的方法

• 在表达荧光标记旋转酶（GyrB-GFP）的活体大肠杆菌细胞中进行了高速单分子荧光成像。
• 使用环丙沙星将旋转酶捕获在催化中间态，以实现对活性复合物的可视化。
• 通过时间序列成像捕捉单个旋转酶分子的动态行为，以测量其停留时间。
• 通过复制体和染色体结构标记物，分析旋转酶分子相对于复制叉的亚细胞定位。
• 在不同基因组背景下量化旋转酶分子的停留时间：分散分布与靠近复制体的区域。

实验结果

研究问题

• RQ1 在任何给定时间，活体大肠杆菌中稳定结合于染色体的旋转酶分子数量是多少？
• RQ2 旋转酶分子在不同亚细胞位置的停留时间是多少，特别是在复制叉附近？
• RQ3 旋转酶在染色体分散结合与靠近复制体的定位时，其活性有何差异？
• RQ4 在活体内，旋转酶是否对复制叉前方的正超螺旋执行持续性松弛？
• RQ5 旋转酶在维持负超螺旋稳态水平中的功能角色是什么？

主要发现

• 在任何给定时间，约300个旋转酶分子稳定结合于大肠杆菌染色体，表明染色体占据率很高。
• 在染色体上分散分布的旋转酶分子停留时间约为2秒，与维持稳态负超螺旋一致。
• 靠近复制体的旋转酶分子停留时间显著更长，约为8秒，表明其执行正超螺旋的持续性松弛。
• 在复制叉附近停留时间的延长与解决DNA复制过程中产生的拓扑应激需求相关。
• 环丙沙星捕获实验证实，所观察到的复合物代表了旋转酶的活性催化中间态。