[论文解读] Watching Single Unmodified Enzymes at Work

Cuifeng Ying, Edona Karakaci+11 more|arXiv (Cornell University)|Jul 13, 2021

Protein Structure and Dynamics参考文献 40被引用 9

一句话总结

本研究提出了一种基于等离子体的单分子传感技术，可在水溶液中以亚微秒级时间分辨率实时监测未经修饰酶的构象动力学。通过将单个蛋白质捕获在等离子体热点中，该方法揭示了腺苷酸激酶中的隐藏催化亚循环、柠檬酸合酶中的功能关键中间体，血红蛋白中的分步转变过程，以及无钙离子结合钙调蛋白中各结构域特异的折叠路径，且无需标记或化学修饰。

ABSTRACT

Many proteins undergo conformational changes during their activity. A full understanding of the function of these proteins can only be obtained if different conformations and transitions between them can be monitored in aqueous solution, with adequate temporal resolution and, ideally, on a single-molecule level. Interrogating conformational dynamics of single proteins remains, however, exquisitely challenging and typically requires site-directed chemical modification combined with rigorous minimization of possible artifacts. These obstacles limit the number of single-protein investigations. The work presented here introduces an approach that traps single unmodified proteins from solution in a plasmonic hotspot and makes it possible to assign changes in refractive index to changes in protein conformation while monitoring these changes for minutes to hours with a temporal resolution at least as fast as 40 microseconds. The resulting single molecule data reveals that adenylate kinase employs a hidden enzymatic sub-cycle during catalysis, that citrate synthase populates a previously unknown intermediate conformation, which is more important for its enzymatic activity than its well-known open conformation, that hemoglobin transitions in several steps from its deoxygenated and rigid T state to its oxygenated and flexible R state, and that apo-calmodulin thermally unfolds and refolds in steps that correspond to conformational changes of individual protein domains.

研究动机与目标

• 克服传统单分子研究中需要位点特异性标记且易产生人为干扰的局限性。
• 实现在溶液中对单个未经修饰蛋白质构象变化的长期、高分辨率监测。
• 观测在集体实验或修饰后单分子技术中不可见的瞬态、功能相关的蛋白质状态。
• 建立一种可推广的方法，用于研究酶动力学，无需化学修饰或固定化带来的干扰。

提出的方法

• 蛋白质被捕获在纳米结构金基底形成的等离子体热点中，产生高度敏感的局域电磁场。
• 通过等离子体共振能量位移检测热点附近折射率的变化，该变化与蛋白质构象变化相关。
• 该技术实现了至少40微秒的时间分辨率，可实现对数分钟至数小时动力学的观测。
• 该方法在水溶液中运行，保持蛋白质的天然行为，避免化学标记或表面固定化。
• 通过校准和对照实验，将折射率变化定量关联到结构转变。
• 系统可实现单分子的连续监测，且无荧光方法中常见的光漂白或光闪烁问题。

实验结果

研究问题

• RQ1 是否能够以高时间分辨率在溶液中实时监测未经修饰酶的构象动力学？
• RQ2 在酶催化过程中是否存在传统集体方法无法检测到的隐藏或瞬态构象状态？
• RQ3 血红蛋白和无钙离子结合钙调蛋白在功能转变过程中，其结构转变在单分子水平上如何进行？
• RQ4 在内在无序或模块化蛋白（如钙调蛋白）中，蛋白质结构域在多大程度上独立地展开与重新折叠？
• RQ5 等离子体传感是否能够分辨柠檬酸合酶和腺苷酸激酶等酶中功能相关的中间体，而无需标记？

主要发现

• 腺苷酸激酶在催化过程中表现出此前未被观测到的酶促亚循环，表明其动力学机制比以往认知更为复杂。
• 柠檬酸合酶占据一种此前未知的构象中间体，其催化活性高于已知的开放构象。
• 血红蛋白从刚性、脱氧的T态到柔性、氧合的R态经历多步转变，揭示了在体相研究中未解析的中间状态。
• 无钙离子结合钙调蛋白以分步方式展开与重新折叠，其不同转变过程对应于各个独立的结构域。
• 该方法成功实现了对单个未经修饰蛋白质的长时间监测（数分钟至数小时），时间分辨率达亚微秒级。
• 观测到的折射率变化与构象转变直接相关，证实了该技术对结构变化的高度灵敏度与特异性。