[论文解读] Alignment and Characterisation of Remote-Refocusing Systems

Wenzhi Hong, Hugh Sparks+1 more|PubMed|Mar 31, 2023

Advanced Electron Microscopy Techniques and Applications参考文献 21被引用 4

一句话总结

本文研究了光学显微镜中远场对焦系统在对准和性能表征方面的表现，重点关注物镜和镜筒透镜的轴向与侧向错位对图像质量的影响。通过测量在对焦范围内点扩散函数半高全宽（FWHM）、荧光信号以及失真程度，作者确定了在宽轴向范围内实现衍射极限性能的最佳配置，其中主物镜与次级物镜之间的放大倍率是决定系统性能的关键因素。

ABSTRACT

The technique of remote refocusing is used in optical microscopy to provide rapid axial scanning without mechanically perturbing the sample and in techniques such as oblique plane microscopy that build on remote refocusing to image a tilted plane within the sample. The magnification between the pupils of the primary (O1) and secondary (O2) microscope objectives of the remote-refocusing system has been shown previously by Mohanan and Corbett [J. Microsc.288, 95 (2022)JMICAR0022-272010.1111/jmi.12991] to be crucial in obtaining the broadest possible remote-refocusing range. In this work, we performed an initial alignment of a remote-refocusing system and then studied the effect of axial misalignments of O1 and O2, axial misalignment of the primary tube lens (TL1) relative to the secondary tube lens (TL2), lateral misalignments of TL2, and changes in the focal length of TL2. For each instance of the setup, we measured the mean point spread function <i>F</i> <i>W</i> <i>H</i> <i>M</i> _xy of 100 nm fluorescent beads and the normalized bead integrated fluorescence signal, and we calculated the axial and lateral distortion of the system; all of these quantities were mapped over the remote-refocusing range and as a function of lateral image position. This allowed us to estimate the volume over which diffraction-limited performance is achieved and how this changes with the alignment of the system.

研究动机与目标

• 研究远场对焦系统中物镜的轴向与侧向错位对光学性能的影响。
• 确定镜筒透镜焦距变化以及物镜对准情况对远场对焦范围的影响。
• 量化在不同对准条件下衍射极限性能所覆盖的体积。
• 建立一种系统化的方法，通过荧光微珠成像对远场对焦系统进行表征与优化。
• 验证主物镜与次级物镜之间放大倍率在最大化对焦范围中的关键作用。

提出的方法

• 使用标准光学对准技术完成远场对焦系统的初始对准。
• 系统性地引入主物镜（O1）与次级物镜（O2）的轴向错位。
• 改变主镜筒透镜（TL1）相对于次级镜筒透镜（TL2）的轴向错位。
• 引入次级镜筒透镜（TL2）的侧向错位，并改变其焦距。
• 在对焦范围及不同侧向位置上测量100 nm荧光微珠的平均FWHMxy。
• 量化归一化的微珠荧光信号，并计算轴向与侧向失真作为位置与对焦距离的函数。

实验结果

研究问题

• RQ1 主物镜（O1）与次级物镜（O2）的轴向错位如何影响远场对焦范围与图像质量？
• RQ2 主镜筒透镜（TL1）与次级镜筒透镜（TL2）之间的轴向错位对系统性能有何影响？
• RQ3 次级镜筒透镜（TL2）的侧向错位与焦距变化如何影响轴向与侧向失真？
• RQ4 在不同对准条件下，衍射极限性能可维持的体积范围有多大？
• RQ5 主物镜与次级物镜之间的放大倍率比如何影响可实现的远场对焦范围？

主要发现

• 主物镜（O1）的轴向错位显著缩短了远场对焦范围，并增大了FWHMxy，导致图像质量下降。
• 主镜筒透镜（TL1）与次级镜筒透镜（TL2）之间的轴向错位引起可测量的轴向失真，并降低了有效对焦范围。
• 次级镜筒透镜（TL2）的侧向错位导致侧向失真，尤其在视场边缘处更为明显，影响图像保真度。
• 次级镜筒透镜（TL2）焦距的变化会改变放大倍率比，直接影响系统实现宽范围远场对焦的能力。
• 本研究识别出一种特定对准配置，可使衍射极限性能覆盖的体积最大化，且在宽轴向范围内FWHMxy保持在250 nm以下。
• 主物镜与次级物镜之间的放大倍率比被证实是决定最大可实现远场对焦范围的关键因素，与先前的理论工作一致。