[论文解读] Antimalarial Artefenomel Inhibits Human SARS-CoV-2 Replication in Cells while Suppressing the Receptor ACE2

Tania Massignan, Alberto Boldrini+11 more|arXiv (Cornell University)|Apr 28, 2020

SARS-CoV-2 and COVID-19 Research参考文献 34被引用 8

一句话总结

本研究通过一种针对折叠中间体的新型方法PPI-FIT，发现抗疟药物artefernomel可有效抑制SARS-CoV-2在人源细胞中的复制，其机制为通过下调ACE2表达实现。Artefernomel完全阻止了活病毒（MEX-BC2/2020株）引起的细胞病变效应，显示出强效抗病毒活性，并具有潜在的新冠治疗药物再利用价值。

ABSTRACT

The steep climbing of victims caused by the new coronavirus disease 2019 (COVID-19) throughout the planet is sparking an unprecedented effort to identify effective therapeutic regimens to tackle the pandemic. The SARS-CoV-2 virus is known to gain entry into various cell types through the binding of one of its surface proteins (spike) to the host Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2). Thus, spike-ACE2 interaction represents a major target for vaccines and antiviral drugs. A novel method has been recently described by some of the authors to pharmacologically downregulate the expression of target proteins at the post-translational level. This technology builds on computational advancements in the simulation of folding mechanisms to rationally block protein expression by targeting folding intermediates, hence hampering the folding process. Here, we report the all-atom simulations of the entire sequence of events underlying the folding pathway of ACE2. Our data revealed the existence of a folding intermediate showing two druggable pockets hidden in the native conformation. Both pockets were targeted by a virtual screening repurposing campaign aimed at quickly identifying drugs capable to decrease the expression of ACE2. We identified four compounds capable of lowering ACE2 expression in Vero cells in a dose-dependent fashion. All these molecules were found to inhibit the entry into cells of a pseudotyped retrovirus exposing the SARS-CoV-2 spike protein. Importantly, the antiviral activity has been tested against live SARS-CoV-2 (MEX-BC2/2020 strain). One of the selected drugs (Artefenomel) could completely prevent cytopathic effects induced by the presence of the virus, thus showing antiviral activity against SARS-CoV-2. Ongoing studies are further evaluating the possibility of repurposing these drugs for the treatment of COVID-19.

研究动机与目标

• 识别可重新利用的药物，通过下调ACE2表达以阻断SARS-CoV-2进入人源细胞。
• 应用PPI-FIT方法——靶向ACE2的折叠中间体——以发现可降低ACE2水平但不完全消除的化合物。
• 评估所识别化合物在Vero细胞中对活SARS-CoV-2的抗病毒活性。
• 通过细胞毒性试验和假病毒进入实验评估候选药物的安全性和特异性。

提出的方法

• 通过全原子分子动力学模拟重建ACE2的完整折叠路径，识别出瞬态折叠中间体。
• 在ACE2的一个折叠中间体中鉴定出两个药物可及的口袋，这些口袋在天然构象中不可见，但在配体结合时可被接近。
• 利用这些口袋进行虚拟筛选，以重新利用现有药物，筛选出可能稳定中间体并促进其降解的化合物。
• 在Vero细胞中通过表达SARS-CoV-2刺突蛋白的假病毒系统验证命中化合物，评估其对病毒进入的抑制作用。
• 使用中性红摄取法测试抗病毒活性，以测量活SARS-CoV-2（MEX-BC2/2020株）引起的细胞病变效应和细胞存活率。
• 进行剂量反应和细胞毒性试验，以确定候选化合物的IC50值和选择性指数。

实验结果

研究问题

• RQ1 PPI-FIT方法能否识别出选择性下调ACE2表达的小分子，其作用机制为靶向ACE2的折叠中间体？
• RQ2 所鉴定的化合物是否能抑制假病毒SARS-CoV-2刺突蛋白介导的进入Vero细胞？
• RQ3 Artefernomel在体外是否对活SARS-CoV-2表现出显著抗病毒活性？
• RQ4 Artefernomel的抗病毒效应是否具有特异性且在有效浓度下无毒性？
• RQ5 现有药物是否可被重新利用，通过ACE2下调抑制SARS-CoV-2进入，且不会引起全身性损害？

主要发现

• 全原子模拟揭示ACE2存在一个折叠中间体，其包含两个在天然构象中不可见但具有药物可及性的口袋。
• 虚拟筛选识别出四种化合物——Ziprasidone、Buclizine、Beclabuvir和Artefenomel——在Vero细胞中呈剂量依赖性降低ACE2表达。
• 上述四种化合物均抑制假病毒SARS-CoV-2刺突蛋白介导的进入Vero细胞，表明其干扰了病毒进入过程。
• Artefernomel在Vero细胞中完全阻止了活SARS-CoV-2（MEX-BC2/2020株）诱导的细胞病变效应，表明其完全抑制了病毒复制。
• 细胞毒性试验显示，在有效抗病毒浓度下未观察到显著细胞死亡，表明具有有利的治疗窗。
• 细胞存活率检测的信号-本底比为29倍，证实了该检测方法具有高度的稳健性和可靠性。