[论文解读] Bistability of an In Vitro Synthetic Autoregulatory Switch

Pakpoom Subsoontorn, Jongmin Kim+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 4, 2011

Gene Regulatory Network Analysis参考文献 83被引用 36

一句话总结

本研究通过使用四种DNA链和三种酶（T7 RNA聚合酶、RNase H和RNase R），在体外合成的DNA开关中实现了正反馈自调节下的双稳态。该开关通过其RNA输出实现自激活，利用热力学控制的RNA-DNA杂交实现稳定的开/关状态，其中RNase H促进双稳态，RNase R通过降解不完全转录本确保信号保真度。

ABSTRACT

The construction of synthetic biochemical circuits is an essential step for developing quantitative understanding of information processing in natural organisms. Here, we report construction and analysis of an in vitro circuit with positive autoregulation that consists of just four synthetic DNA strands and three enzymes, bacteriophage T7 RNA polymerase, Escherichia coli ribonuclease (RNase) H, and RNase R. The modularity of the DNA switch template allowed a rational design of a synthetic DNA switch regulated by its RNA output acting as a transcription activator. We verified that the thermodynamic and kinetic constraints dictated by the sequence design criteria were enough to experimentally achieve the intended dynamics: a transcription activator configured to regulate its own production. Although only RNase H is necessary to achieve bistability of switch states, RNase R is necessary to maintain stable RNA signal levels and to control incomplete degradation products. A simple mathematical model was used to fit ensemble parameters for the training set of experimental results and was then directly applied to predict time-courses of switch dynamics and sensitivity to parameter variations with reasonable agreement. The positive autoregulation switches can be used to provide constant input signals and store outputs of biochemical networks and are potentially useful for chemical control applications.

研究动机与目标

• 设计并构建一个仅使用DNA和少量酶的最小化体外合成自调节开关，实现正反馈。
• 在无蛋白质调节子的条件下，通过RNA-DNA杂交实现调控，证明合成生化回路中的双稳态。
• 表征调控开关行为和信号稳定性的动力学与热力学约束。
• 通过贝叶斯推断拟合简单数学模型，验证实验动力学。
• 探索此类开关在合成生化网络中用于信号存储和化学控制的潜力。

提出的方法

• 该开关由四种合成DNA链构成：带有启动子的模板（T-nt）、转录输出（rA）、激活子（A）和抑制子（dI），其中rA通过RNA-DNA杂交作为自身转录激活子。
• 转录由T7 RNA聚合酶驱动，RNase H通过切割RNA-DNA杂交体使反馈回路得以运行，而RNase R则降解残留的RNA片段以防止信号噪声。
• 系统在纯化的体外环境中运行，以NTP作为能量来源，最大限度减少与细胞机器的非预期相互作用。
• 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱法定量测量RNA输出水平随时间的变化，以表征开关动力学。
• 建立包含11个速率常数（如k_T_A、k_M_ON、k_cat_OFF）的动力学模型，并通过马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法结合贝叶斯推断对实验数据进行拟合。
• 从后验分布中抽样参数集，以预测开关行为及其对浓度变化的敏感性。

实验结果

研究问题

• RQ1 仅使用DNA和少量酶的最小化体外合成回路能否通过正反馈自调节实现双稳态切换？
• RQ2 RNase H和RNase R在实现和稳定开关的开启与关闭状态中分别发挥什么作用？
• RQ3 具有集合参数的简单动力学模型在多大程度上能准确预测开关动力学和参数敏感性？
• RQ4 DNA和酶浓度的变化在多大程度上影响开关行为和双稳态？
• RQ5 该自激活开关能否在合成生化网络中作为可靠的信号重复器或记忆元件？

主要发现

• 自激活开关表现出明显的双稳态，其RNA输出的高/低稳定状态取决于初始条件，经凝胶电泳和荧光测量证实。
• RNase H对双稳态至关重要，因其能切割由激活子rA形成的RNA-DNA杂交体，从而实现反馈回路的运行。
• RNase R必须降解不完全的转录产物，以防止错误激活并确保信号保真度。
• 通过贝叶斯推断对50个实验数据点进行拟合的动力学模型，成功以合理精度预测了时间进程动态和参数敏感性。
• 模型的参数95%置信区间基于620,000次MCMC迭代后抽样的51组参数集得出，证实了预测的稳健性。
• 通过组分浓度可调谐开关行为，切换阈值和输出水平可独立于结合结构域设计进行调节。