[论文解读] Bright and fast voltage reporters across the visible spectrum via electrochromic FRET (eFRET)

Peng Zou, Yongxin Zhao+7 more|arXiv (Cornell University)|Mar 18, 2014

Photoreceptor and optogenetics research参考文献 33被引用 5

一句话总结

本文提出了一种基于电致变色Förster共振能量转移（eFRET）的基因编码电压成像系统，其中电压敏感的视紫红质结构域通过调节连接荧光蛋白的荧光猝灭来响应膜电位变化。该系统在可见光谱范围内实现了明亮、快速的电压报告，灵敏度为每100 mV 6–10% ΔF/F，响应时间小于1毫秒，可实现神经元中高信噪比的多色电压成像。

ABSTRACT

We present a palette of brightly fluorescent genetically encoded voltage indicators (GEVIs) with excitation and emission peaks spanning the visible spectrum, sensitivities from 6 - 10% Delta F/F per 100 mV, and half-maximal response times from 1 - 7 ms. A fluorescent protein is fused to an Archaerhodopsin-derived voltage sensor. Voltage-induced shifts in the absorption spectrum of the rhodopsin lead to voltage-dependent nonradiative quenching of the appended fluorescent protein. Through a library screen, we identified linkers and fluorescent protein combinations which reported neuronal action potentials in cultured rat hippocampal neurons with a single-trial signal-to-noise ratio from 6.6 to 11.6 in a 1 kHz imaging bandwidth at modest illumination intensity. The freedom to choose a voltage indicator from an array of colors facilitates multicolor voltage imaging, as well as combination with other optical reporters and optogenetic actuators.

研究动机与目标

• 开发一套覆盖可见光谱的基因编码电压指示剂（GEVIs）组合，用于多色成像。
• 实现高灵敏度（每100 mV 6–10% ΔF/F）和快速响应时间（<7 ms），以可靠检测动作电位。
• 通过颜色多样性实现与光遗传学工具及其他光学报告系统兼容。
• 鉴定在活体神经元中实现稳定电压报告的最优荧光蛋白与连接子组合。

提出的方法

• 将源自古菌视紫红质的电压敏感视紫红质结构域与荧光蛋白融合，构建eFRET系统。
• 利用视紫红质在电压变化下引起的光谱位移，调节向荧光团的非辐射能量转移。
• 筛选荧光蛋白-连接子融合蛋白文库，以优化亮度、灵敏度和响应动力学。
• 在体外及原代大鼠海马神经元中测量电压依赖性荧光猝灭。
• 采用1 kHz成像带宽，在生理光照条件下评估信噪比（SNR）。
• 基于信噪比、响应时间及光谱特性，筛选适用于活体应用的最优构建体。

实验结果

研究问题

• RQ1 单一eFRET平台能否实现可见光谱范围内可调谐激发与发射的电压报告？
• RQ2 在电压传感中，何种荧光蛋白与连接子组合可实现最高灵敏度与最快响应？
• RQ3 这些报告系统能否在活体神经元中以高信噪比分辨单个动作电位？
• RQ4 通过该eFRET报告系统，多色电压成像在多大程度上可实现？
• RQ5 光照强度在多大程度上影响这些报告系统对动作电位的可检测性？

主要发现

• eFRET系统生成的电压报告具有覆盖可见光谱的激发与发射最大值。
• 灵敏度范围为每100 mV 6%至10% ΔF/F，可实现膜电位变化的稳健检测。
• 响应时间最快可达1 ms，所有构建体在≤7 ms内达到半最大响应。
• 在原代大鼠海马神经元中，单次试验的信噪比在1 kHz成像带宽下为6.6至11.6。
• 由于存在光谱分离的报告系统，该系统实现了多色电压成像。
• 最优构建体在适度光照条件下仍保持高性能，适用于活细胞成像。