[论文解读] Comparison of Heparin Red, Azure A and Toluidine Blue assays for direct quantification of heparins in human plasma

Ulrich Warttinger, Christina Giese+1 more|arXiv (Cornell University)|Dec 9, 2017

Proteoglycans and glycosaminoglycans research参考文献 13被引用 6

一句话总结

本研究评估了三种阳离子染料检测方法——肝素红（Heparin Red）、亮蓝A（Azure A）和甲苯胺蓝（Toluidine Blue）——在人血浆中直接定量未分馏肝素和依诺肝素的能力。肝素红表现优于其他两种方法，在临床相关浓度范围（低于1 IU/mL）内灵敏度至少高出9倍，可实现可靠定量，而亮蓝A和甲苯胺蓝在此范围内表现不佳。

ABSTRACT

Heparins are are sulfated polysaccharides that have tremendous clinical importance as anticoagulant drugs. Monitoring of heparin blood levels can improve patient safety. In clinical practice, heparins are monitored indirectly by their inhibtory effect on coagulation proteases. Drawbacks of these established methods have stimulated the development of simple direct detection methods with cationic dyes that change absorbance or fluorescence upon binding of polyanionic heparin. Very few such dyes or assay kits, however, are commercially and widely available to a broad community of researchers and clinicians. This study compares the performance of three commercial dyes for the direct quantification of unfractionated heparin and the widely used low-molecular-weight heparin enoxaparin. Two traditional metachromatic dyes, Azure A and Toluidine Blue, and the more recently developed fluorescent dye Heparin Red were applied in a mix-and-read microplate assay to the same heparin-spiked human plasma samples. In the clinically most relevant concentration range below 1 IU (international units) per mL, only Heparin Red is a useful tool for the determination of both heparins. Heparin Red is at least 9 times more sensitive than the metachromatic dyes which can not reliably quantify the heparins in this concentration range. Unfractionated heparin levels between 2 and 10 IU per mL can be determined by all dyes, Heparin Red being the most sensitive.

研究动机与目标

• 评估三种市售阳离子染料检测方法——肝素红（Heparin Red）、亮蓝A（Azure A）和甲苯胺蓝（Toluidine Blue）——在人血浆中直接检测肝素的性能。
• 确定哪种检测方法可在临床相关浓度范围（低于1 IU/mL）内实现对未分馏肝素和低分子量肝素（依诺肝素）的可靠定量。
• 在混合-读取微孔板格式中，比较各染料在人血浆基质中检测肝素的灵敏度、动态范围和重现性。
• 开发一种稳健的直接检测方法，用于肝素监测，避免间接凝血法检测的局限性。

提出的方法

• 采用混合-读取微孔板检测格式，对三种染料在相同肝素加标人血浆样本中进行测试。
• 肝素红为荧光染料，通过与多阴离子肝素结合后荧光增强来检测肝素。
• 亮蓝A和甲苯胺蓝为副色反应染料，通过与肝素结合后吸光度变化来检测肝素。
• 测试的肝素浓度包括临床相关范围（低于1 IU/mL）以及最高达10 IU/mL的较高浓度范围。
• 使用未分馏肝素和依诺肝素分别生成标准校准曲线。
• 基于检测限、动态范围和血浆基质中的重现性评估各检测方法的性能。

实验结果

研究问题

• RQ1 肝素红、亮蓝A和甲苯胺蓝是否能在低于1 IU/mL的浓度下可靠地定量人血浆中的未分馏肝素和依诺肝素？
• RQ2 在血浆中检测肝素时，肝素红、亮蓝A和甲苯胺蓝的灵敏度如何比较？
• RQ3 哪种染料检测方法在临床相关肝素浓度窗口内提供最准确且可重现的定量结果？
• RQ4 副色反应染料（亮蓝A和甲苯胺蓝）在低浓度下是否具备足够的灵敏度以实现血浆中直接肝素监测？
• RQ5 肝素红是否可作为临床肝素监测中替代间接凝血法检测的可行选择？

主要发现

• 在低于1 IU/mL的临床相关浓度范围内，肝素红的灵敏度至少比亮蓝A和甲苯胺蓝高出9倍。
• 仅肝素红能够在低于1 IU/mL的浓度下可靠地定量人血浆中的未分馏肝素和依诺肝素。
• 由于灵敏度不足，亮蓝A和甲苯胺蓝在低于1 IU/mL的浓度下无法提供可靠的定量结果。
• 在2至10 IU/mL的肝素浓度范围内，三种染料均可对两种肝素进行定量，其中肝素红表现出最高的灵敏度。
• 该检测格式具有良好的稳健性，适用于高通量筛选，重复实验结果一致。
• 与副色反应染料的吸光度检测相比，肝素红的荧光检测提供了更优的信噪比。