[论文解读] Correcting a SHAPE-directed RNA structure by a mutate-map-rescue approach

Siqi Tian, Pablo Cordero+2 more|arXiv (Cornell University)|Jan 21, 2014

RNA and protein synthesis mechanisms参考文献 57被引用 44

一句话总结

本研究通过结合高通量突变、SHAPE探测和功能拯救的mutate-map-rescue方法，纠正了先前对核糖体RNA构象变化的错误推断。该方法以接近晶体学的精度揭示了16S rRNA结构域的真实二级结构，并识别出一种可通过单核苷酸移位访问的功能性相关瞬态构象状态，从而修正了早期基于SHAPE的误判。

ABSTRACT

The three-dimensional conformations of non-coding RNAs underpin their biochemical functions but have largely eluded experimental characterization. Here, we report that integrating a classic mutation/rescue strategy with high-throughput chemical mapping enables rapid RNA structure inference with unusually strong validation. We revisit a paradigmatic 16S rRNA domain for which SHAPE (selective 2`-hydroxyl acylation with primer extension) suggested a conformational change between apo- and holo-ribosome conformations. Computational support estimates, data from alternative chemical probes, and mutate-and-map (M2) experiments expose limitations of prior methodology and instead give a near-crystallographic secondary structure. Systematic interrogation of single base pairs via a high-throughput mutation/rescue approach then permits incisive validation and refinement of the M2-based secondary structure and further uncovers the functional conformation as an excited state (25+/-5% population) accessible via a single-nucleotide register shift. These results correct an erroneous SHAPE inference of a ribosomal conformational change and suggest a general mutate-map-rescue approach for dissecting RNA dynamic structure landscapes.

研究动机与目标

• 解决基于SHAPE的16S rRNA结构域RNA结构不一致的问题。
• 通过实验性突变和功能拯救，验证并优化先前提出的核糖体构象变化。
• 开发一种可推广的方法，以高精度探测动态RNA结构景观。
• 确定16S rRNA中观察到的构象变化是稳定结构特征，还是瞬态、低丰度状态。

提出的方法

• 对16S rRNA结构域中的单个碱基对进行系统性破坏的高通量突变。
• 利用SHAPE化学探针检测突变构建体中的RNA柔性度和结构变化。
• 通过功能拯救实验评估突变的表型影响，并验证结构模型。
• 将mutate-and-map（M2）数据与计算建模相结合，推断二级结构。
• 将M2推导的结构与来自其他化学探针和晶体学参考数据进行比较。
• 对突变体群体进行定量分析，以估算瞬态构象状态的占位分数。

实验结果

研究问题

• RQ1 基于SHAPE的16S rRNA结构域构象变化是否代表一种稳定结构转变，还是瞬态、低丰度状态？
• RQ2 系统性的mutate-map-rescue方法能否纠正基于SHAPE数据的RNA结构推断错误？
• RQ3 经功能和化学探针验证后，16S rRNA结构域的真实二级结构是什么？
• RQ4 是否存在一个单核苷酸移位，可使RNA进入一种功能相关的瞬态构象状态？

主要发现

• 先前基于SHAPE推断的核糖体构象变化是错误的；观察到的变化是方法学局限性的产物。
• 通过mutate-map-rescue方法，以接近晶体学的精度确定了16S rRNA结构域的真实二级结构。
• 一种具有功能相关性的构象状态作为激发态存在，其在溶液中的种群比例为25±5%。
• 该激发态可通过RNA序列中的单核苷酸移位被访问。
• mutate-map-rescue方法成功验证并优化了基于M2的二级结构模型。
• 本研究证明，动态的、低丰度的RNA构象可具有功能性意义，并可通过系统性突变和探针检测到。