[论文解读] CRISPR/Cas9 For Photoactivated Localization Microscopy (PALM)

Yina Zhu, Pingchuan Li+6 more|arXiv (Cornell University)|Mar 26, 2014

Advanced biosensing and bioanalysis techniques被引用 3

一句话总结

本文提出一种基于CRISPR/Cas9的系统，利用dCas9-mEos3.1融合蛋白实现对重复基因组元件的光激活定位显微镜（PALM）成像，达到亚衍射分辨率。通过引导RNA将dCas9靶向特定DNA序列，并利用mEos3.1的光可转换特性，该方法实现了在内源性重复基因座处对染色质结构的高精度成像，为研究染色质高级结构提供了新工具。

ABSTRACT

We demonstrate that endonuclease deficient Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-associated Cas9 protein (dCas9) fused to the photo-convertible fluorescence protein monomeric mEos3.1 (dCas9-mEos3) can be used to resolve sub-diffraction limited features of repetitive gene elements, thus providing a new route to investigate high-order chromatin organization at these sites.

研究动机与目标

• 开发一种在活细胞中对重复基因组元件实现高分辨率成像的方法。
• 克服传统PALM技术在可视化内源性重复DNA序列方面的局限性。
• 实现在不进行基因组过表达的情况下，对内源性基因座处染色质结构的亚衍射定位。
• 利用CRISPR/Cas9的靶向特异性，对染色体区域进行精确标记。
• 提供一种用于研究重复基因元件处染色质高级组织结构的工具。

提出的方法

• 使用催化活性缺失的dCas9与光可转换荧光蛋白mEos3.1融合，实现基因组位点的靶向标记。
• 设计引导RNA（gRNA）以将dCas9-mEos3.1引导至特定的重复DNA序列，如卫星重复序列。
• 采用光激活将mEos3.1从绿色荧光转换为红色荧光，实现PALM中的单分子定位。
• 利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对单个、光激活的mEos3.1分子进行成像，实现高空间精度。
• 通过顺序光激活与单分子定位，重建染色体区域的超分辨率图像。
• 通过对照实验与已知基因组标记的比较，验证靶向特异性。

实验结果

研究问题

• RQ1 dCas9-mEos3.1能否实现对内源性重复基因组元件的亚衍射分辨率成像？
• RQ2 CRISPR/Cas9系统是否能实现对mEos3.1在重复染色体位点的特异性与稳定靶向？
• RQ3 光激活的mEos3.1能否在活细胞中提供足够的信噪比与定位精度，以支持超分辨率显微镜成像？
• RQ4 dCas9-mEos3.1点状结构的空间分布与重复区域已知的染色质组织特征相比如何？
• RQ5 该方法是否适用于在不进行基因改造的情况下研究内源性位点处染色质的高级结构？

主要发现

• dCas9-mEos3.1融合蛋白成功以高特异性靶向了重复基因组元件，如卫星重复序列。
• 实现了亚衍射分辨率成像，以纳米尺度精度分辨出内源性重复基因座处的单个点状结构。
• mEos3.1的光激活实现了单分子定位，从而能够重建染色质结构的超分辨率图像。
• 该方法可在不依赖过表达或内源性标签的情况下，实现对内源性位点染色质组织的可视化。
• 对照实验证实，标记依赖于gRNA和功能完整的dCas9，验证了靶向特异性。
• 该系统在多个实验中均表现出对活细胞中重复元件成像的鲁棒性与可重复性。