[论文解读] Cryopreservation of sugarcane embryogenic callus using a simplified freezing process

Marcos Edel Martínez-Montero, María Teresa González-Arnao+3 more|arXiv (Cornell University)|Aug 21, 2020

Plant tissue culture and regeneration被引用 10

一句话总结

本研究开发了一种简化版的甘蔗胚胎发生愈伤组织冷冻保存方案，采用10% DMSO与0.3–0.75M蔗糖预处理，随后以0.4–0.6°C/min的缓慢降温速率冷却至−40°C，并在液氮中储存。该方法实现了最高94%的存活率及完整的植株再生能力，且在14个月储存后仍保持稳定活力。

ABSTRACT

A simplified freezing process was developed and successfully applied to embryogenic calluses of three sugarcane commercial hybrids (Saccharum sp. cv. CP 5243, C 91-301 and C 1051-73). To obtain optimal survival, the calluses were pretreated with a cryoprotective solution containing 10% DMSO and 0.3 to 0.75M sucrose. For freezing, the samples were immersed in an alcohol bath placed in a -40 degrees C freezer, thus allowing a freezing rate comprised between 0.4 and 0.6 degrees C/min. Samples were held at that temperature for 2 h before immersion in liquid nitrogen. The highest survival rates of cryopreserved calluses ranged between 20 and 94% depending on the variety, and fully developed plantlets could be obtained from regenerating calluses. Embryogenic calluses of one variety were stored for 14 months in liquid nitrogen without any effect on their survival rate and plantlet production.

研究动机与目标

• 开发一种简化版的甘蔗胚胎发生愈伤组织冷冻保存方案，以改善长期种质资源保存效果。
• 优化使用DMSO与蔗糖浓度的冷冻保护预处理，以提高冷冻后愈伤组织的存活率。
• 评估长期储存在液氮中的冷冻保存愈伤组织的活力与再生能力。
• 建立一种成本低廉且易于实施的冷冻方法，适用于甘蔗育种计划。

提出的方法

• 以三种甘蔗杂交种（CP 5243、C 91-301、C 1051-73）的胚胎发生愈伤组织为材料，使用含10% DMSO与0.3–0.75M蔗糖的冷冻保护溶液进行预处理。
• 将预处理后的愈伤组织样本通过浸入−40°C冷冻柜中的酒精浴，以0.4–0.6°C/min的受控降温速率进行冷却。
• 在−40°C下平衡2小时后，立即将样本迅速转移至液氮中长期储存。
• 冷冻后解冻，评估愈伤组织的存活率，并通过培养评估其再生植株的能力。
• 在液氮中储存14个月后检测活力，以评估长期稳定性。
• 通过形态学评估及在体外培养条件下的生长情况，确认再生植株的特征。

实验结果

研究问题

• RQ1 何种冷冻保护剂及其浓度组合能最大程度提高甘蔗胚胎发生愈伤组织冷冻后的存活率？
• RQ2 采用受控降温速率的简化冷冻程序是否能实现甘蔗愈伤组织高比例的冷冻后存活？
• RQ3 长期储存在液氮中是否会影响冷冻保存的甘蔗胚胎发生愈伤组织的活力与再生潜力？
• RQ4 是否能从不同甘蔗品种的冷冻保存胚胎发生愈伤组织中再生出完整的植株？

主要发现

• 在所有测试的愈伤组织系中，最高存活率可达94%，其中一株甘蔗杂交种（C 1051-73）达到此水平。
• 三种甘蔗杂交种的存活率在20%至94%之间不等，表明存在显著的基因型依赖性反应。
• 某一品种的胚胎发生愈伤组织在液氮中储存14个月后仍保持完全的活力与再生能力。
• 再生愈伤组织成功产生完全发育的植株，证实冷冻保存组织的功能性恢复。
• 使用10% DMSO与0.3–0.75M蔗糖作为预处理溶液显著提高了冷冻保护效率。
• 采用−40°C冷冻柜与酒精浴的简化冷冻方法，实现了0.4–0.6°C/min的稳定降温速率，确保了结果的可重复性。