[论文解读] Efficient wide-field FLIM

Adam J. Bowman, Brannon B. Klopfer+2 more|arXiv (Cornell University)|Dec 17, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 52被引用 12

一句话总结

本文提出一种基于泡克尔斯细胞的宽场荧光寿命成像（FLIM）技术，具备纳秒级时间分辨率和高光子效率，可在相机帧率下实现单帧FLIM。通过将泡克尔斯细胞与偏振分束器及重成像腔结合，该方法的通量比时间相关单光子计数（TC-SPC）高出10³–10⁵倍，支持多标记FLIM、单分子光谱学和无门控损失的动态成像。

ABSTRACT

Nanosecond temporal resolution enables new methods for wide-field imaging like time-of-flight, gated detection, and fluorescence lifetime. The optical efficiency of existing approaches, however, presents challenges for low-light applications common to fluorescence microscopy and single-molecule imaging. We demonstrate the use of Pockels cells for wide-field image gating with nanosecond temporal resolution and high photon collection efficiency. Two temporal frames are obtained by combining a Pockels cell with a pair of polarizing beam-splitters. We show multi-label fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), single-molecule lifetime spectroscopy, and fast single-frame FLIM at the camera frame rate with $10^3 - 10^5$ times higher throughput than single photon counting. Finally, we demonstrate a space-to-time image multiplexer using a re-imaging optical cavity with a tilted mirror to extend the Pockels cell technique to multiple temporal frames. These methods enable nanosecond imaging with standard optical systems and sensors, opening a new temporal dimension for low-light microscopy.

研究动机与目标

• 解决现有宽场纳秒成像技术在低光荧光显微镜中光子效率低、通量受限的问题。
• 利用标准相机和光学元件，实现高灵敏度、宽场FLIM，具备纳秒级时间分辨率。
• 开发一种光子效率高、无死时间的单帧与多帧FLIM方法，不牺牲图像质量，亦不引入门控伪影。
• 通过重成像光学腔将泡克尔斯细胞门控技术扩展至多个时间帧，实现时间到空间的复用。

提出的方法

• 使用泡克尔斯细胞施加电场依赖的延迟，调制宽场荧光发射的偏振，实现纳秒级时间门控。
• 两个偏振分束器（PBS）在泡克尔斯细胞后分束，产生四个输出图像，编码门脉冲前后的时间强度差异。
• 在泡克尔斯细胞上施加阶跃函数或高斯电压脉冲，形成两个时间窗口，通过两路输出通道的强度比计算荧光寿命。
• 采用带有倾斜镜的重成像光学腔，通过多次反射图像实现多个时间帧，往返时间 t_rt = 8f/c 决定帧间距。
• 该方法依赖于30 mm的KD*P泡克尔斯细胞，其上升时间为4.5 ns，门控效率为80%，并使用分束器进行IRF校准，以校正仪器响应函数。
• 寿命计算基于基于测量强度比和预先表征的IRF的查表法，误差分析考虑了散粒噪声和背景贡献。

实验结果

研究问题

• RQ1 基于泡克尔斯细胞的系统能否在宽场FLIM中实现纳秒级时间分辨率，并具备高光子收集效率？
• RQ2 该技术能否在无死时间或门控损失的情况下，实现在相机帧率下的单帧FLIM？
• RQ3 重成像腔能否将泡克尔斯细胞方法扩展至多个时间帧，实现多帧超快成像？
• RQ4 与传统TC-SPC和门控成像系统相比，该方法的光子效率和信噪比性能如何？
• RQ5 仪器响应函数的空间变化在多大程度上影响视场内各位置的寿命测量精度？

主要发现

• 泡克尔斯细胞系统比时间相关单光子计数（TC-SPC）的通量高出10³–10⁵倍，实现了在相机帧率下的单帧FLIM。
• 该方法实现了高效的多标记FLIM、单分子寿命光谱学以及无死时间或噪声的动态FLIM，避免了传统门控的缺陷。
• 30 mm的KD*P泡克尔斯细胞，上升时间为4.5 ns，门控效率为80%，可在6 mrad半接受角内实现高保真时间分辨率。
• 采用f = 150 mm、t_rt = 4.0 ns的重成像腔，通过将时间复用至空间通道，实现n帧成像，将技术扩展至多个时间窗口。
• 寿命测量显示，由于仪器响应函数的空间变化，尤其在大视场中，会产生位置相关的误差，但已在分析中得到校正。
• Cramér-Rao界分析表明，该方法实现了接近最优的光子效率，归一化不确定性随时间窗口数和积分时间的增加而有利地降低。