[论文解读] Exploiting speckle correlations to improve the resolution of wide-field fluorescence microscopy

Hasan Yılmaz, E.G. van Putten+4 more|University of Twente Research Information|Oct 8, 2014

Random lasers and scattering media参考文献 28被引用 55

一句话总结

本文提出了一种称为斑点相关分辨率增强（SCORE）的方法，利用磷化镓（GaP）散射透镜产生的斑点图案，在宽场荧光显微镜中实现亚衍射极限分辨率。通过利用多个倾斜入射光束角度下的斑点照明相关性，SCORE在不需波前整形或复杂校准的情况下，实现了10×10 µm²视场内130 nm的去卷积分辨率。

ABSTRACT

Fluorescence microscopy is indispensable in nanoscience and biological sciences. The versatility of labeling target structures with fluorescent dyes permits to visualize structure and function at a subcellular resolution with a wide field of view. Due to the diffraction limit, conventional optical microscopes are limited to resolving structures larger than 200 nm. The resolution can be enhanced by near-field and far-field super-resolution microscopy methods. Near-field methods typically have a limited field of view and far-field methods are limited by the involved conventional optics. Here, we introduce a combined high-resolution and wide-field fluorescence microscopy method that improves the resolution of a conventional optical microscope by exploiting correlations in speckle illumination through a randomly scattering high-index medium: Speckle correlation resolution enhancement (SCORE). As a test, we collect two-dimensional fluorescence images of 100-nm diameter dye-doped nanospheres. We demonstrate a deconvolved resolution of 130 nm with a field of view of 10 x 10 $ ext{μm}^2$.

研究动机与目标

• 提出一种简单、无需硬件的新型方法，以克服宽场荧光显微镜中的衍射极限，且无需扫描探针或特殊染料。
• 将视场范围扩展至传统斑点扫描方法受光学记忆效应限制的范围之外。
• 证明斑点相关性可在无需事先表征散射介质或复杂光学控制的情况下提升分辨率。
• 仅通过相干照明和一个散射层，在常规显微镜系统中实现亚200 nm分辨率。

提出的方法

• 使用561 nm波长的相干光束照射磷化镓（GaP）基底，在其表面通过2 µm厚的多孔散射层产生斑点图案。
• 在光学记忆效应范围内（Δθ ≈ 1°）倾斜入射光束，使斑点图案在样品上发生平移，从而实现对物体平面的光栅扫描。
• 使用高数值孔径物镜（NA = 0.95）检测荧光发射，其分辨率为 R = λ_flu/(2NA) = 322 nm，每个光束倾斜角度下捕获全视场图像。
• 通过并行斑点检测，结合多个斑点扫描测量结果，利用斑点图案中的统计相关性重建宽场图像。
• 对重建图像应用数值去卷积，利用已知的点扩散函数提取真实的物体分布并提升分辨率。
• 依赖于不同入射角度下斑点图案的相关性来提取高分辨率信息，避免了波前整形或传输矩阵测量的需求。

实验结果

研究问题

• RQ1 能否利用散射介质中的斑点相关性，在宽场荧光显微镜中实现超越衍射极限的分辨率增强？
• RQ2 在不牺牲分辨率的前提下，斑点基超分辨成像的视场范围可被扩展到何种程度？
• RQ3 是否可在无需事先校准散射介质或复杂光学控制的情况下实现高分辨率成像？
• RQ4 在仅使用常规显微镜物镜和简单散射透镜的实际实现中，可达到的分辨率是多少？

主要发现

• 该方法在10×10 µm²视场内实现了130 nm的去卷积分辨率，显著优于传统显微镜的分辨率极限。
• 两个中心间距为146 nm的100 nm直径荧光纳米微球在SCORE图像中被清晰分辨，而在传统显微镜下则表现为一个未分辨的斑点。
• 去卷积点扩散函数的半高全宽（FWHM）为140 nm，接近给定照明光束宽度下的理论极限116 nm。
• 分辨率增强无需波前整形、传输矩阵测量或对散射介质的预先表征。
• 该方法对样品漂移和激光光束指向噪声具有鲁棒性，当λ_ill = 550 nm时，GaP（n = 3.45）中的分辨率极限可能接近80 nm。
• 理论分析表明，通过结合照明与探测的分辨率极限，分辨率可进一步提升至64 nm，类似于结构光照明显微镜的原理。