[论文解读] Fluorescence energy transfer enhancement in aluminum nanoapertures

Juan de Torres, Petru Ghenuche+3 more|arXiv (Cornell University)|Apr 3, 2015

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 47被引用 26

一句话总结

本研究量化了铝零模波导（ZMWs）中的福能量共振转移（FRET），表明FRET速率与给体衰减速率及局域态密度（LDOS）呈线性关系。由于在绿光波段损耗更低，铝ZMWs比金ZMWs能更显著增强荧光亮度，从而实现在生理微摩尔浓度下的单分子FRET，且对FRET效率的干扰极小。

ABSTRACT

Zero-mode waveguides (ZMWs) are confining light into attoliter volumes, enabling single molecule fluorescence experiments at physiological micromolar concentrations. Among the fluorescence spectroscopy techniques that can be enhanced by ZMWs, Förster resonance energy transfer (FRET) is one of the most widely used in life sciences. Combining zero-mode waveguides with FRET provides new opportunities to investigate biochemical structures or follow interaction dynamics at micromolar concentration with single molecule resolution. However, prior to any quantitative FRET analysis on biological samples, it is crucial to establish first the influence of the ZMW on the FRET process. Here, we quantify the FRET rates and efficiencies between individual donor-acceptor fluorophore pairs diffusing in aluminum zero-mode waveguides. Aluminum ZMWs are important structures thanks to their commercial availability and the large literature describing their use for single molecule fluorescence spectroscopy. We also compare the results between ZMWs milled in gold and aluminum, and find that while gold has a stronger influence on the decay rates, the lower losses of aluminum in the green spectral region provide larger fluorescence brightness enhancement factors. For both aluminum and gold ZMWs, we observe that the FRET rate scales linearly with the isolated donor decay rate and the local density of optical states (LDOS). Detailed information about FRET in ZMWs unlocks their application as new devices for enhanced single molecule FRET at physiological concentrations.

研究动机与目标

• 量化铝零模波导（ZMWs）对单分子研究中福能量共振转移（FRET）的影响。
• 比较铝ZMWs与金ZMWs中的FRET效率与动力学，重点关注等离子体效应与光学损耗。
• 确立铝ZMWs作为在微摩尔浓度下实现增强型单分子FRET的可行平台。
• 通过两种独立方法验证FRET测量：给体寿命缩短与荧光爆发强度分析。
• 确定局域态密度（LDOS）在调控等离子体纳米结构中FRET速率中的作用。

提出的方法

• 使用直径在120至385 nm之间的铝和金ZMWs，研究dsDNA连接物上给体-受体荧光染料之间的FRET。
• 采用荧光相关光谱法（FCS）测量扩散时间、亮度及检测体积减小。
• 利用时间相关单光子计数（TCSPC）测量给体荧光衰减曲线，以提取孤立态与FRET猝灭态下的给体寿命。
• 应用两种独立方法量化FRET：（1）因能量转移导致的给体寿命缩短；（2）受体爆发强度分析。
• 对FCS相关图进行拟合，提取扩散时间、三重态分数、闪烁时间及荧光亮度等参数。
• 计算荧光亮度增强因子与检测体积减小因子，并比较铝ZMWs与金ZMWs的性能。

实验结果

研究问题

• RQ1 铝ZMWs中局域态密度（LDOS）如何影响FRET速率与效率？
• RQ2 等离子体金属选择（铝与金）对FRET效率与荧光亮度增强有何影响？
• RQ3 ZMWs与传统共聚焦显微镜相比，对FRET过程的干扰程度如何？
• RQ4 铝ZMWs中的荧光衰减动力学与金ZMWs相比如何，特别是在非辐射损耗方面？
• RQ5 能否通过两种独立方法可靠地量化ZMWs中的FRET测量？两种方法结果是否一致？

主要发现

• 铝ZMWs中的FRET速率与孤立给体衰减速率及局域态密度（LDOS）均呈线性关系，证实了理论预测。
• 在190 nm直径下，铝ZMWs提供3.3倍的荧光亮度增强，显著高于金的1.5倍，原因在于绿光波段光学损耗更低。
• FRET效率在不同ZMW直径与浓度（最高达4×）下基本保持不变，直至N ≈ 16无显著偏差，表明空间平均效应极小。
• 铝ZMWs中给体荧光寿命从共聚焦下的~3.0 ns缩短至FRET对中的~1.5–2.0 ns，与约50%的能量转移效率一致。
• 金ZMWs表现出约5 ps的快速附加衰减组分，归因于金的光致发光，而铝ZMWs中不存在此现象。
• 等离子体金属的优值因子（|Re(ε)|/|Im(ε)|）表明，在绿光区域（~560 nm）铝优于金，因其更低的虚部减少了损耗。