[论文解读] High-resolution transport-of-intensity quantitative phase microscopy with annular illumination

Chao Zuo, Jiasong Sun+4 more|arXiv (Cornell University)|Apr 13, 2017

Digital Holography and Microscopy参考文献 92被引用 13

一句话总结

本文提出了一种基于环形照明的传输-强度定量相位显微镜（AI-TIE），以克服传统TIE成像在分辨率和对比度方面的局限性。通过将照明孔径从圆形替换为与物镜数值孔径（NA）匹配的环形孔径，该方法显著提升了低空间频率的相位对比度，并实现了208 nm的横向分辨率——相当于有效NA为2.66——从而实现了高保真度、非侵入性、低光毒性且兼容标准明场显微镜的活细胞成像。

ABSTRACT

For quantitative phase imaging (QPI) based on transport-of-intensity equation (TIE), partially coherent illumination provides speckle-free imaging, compatibility with brightfield microscopy, and transverse resolution beyond coherent diffraction limit. Unfortunately, in a conventional microscope with circular illumination aperture, partial coherence tends to diminish the phase contrast, exacerbating the inherent noise-to-resolution tradeoff in TIE imaging, resulting in strong low-frequency artifacts and compromised imaging resolution. Here, we demonstrate how these issues can be effectively addressed by replacing the conventional circular illumination aperture with an annular one. The matched annular illumination not only strongly boosts the phase contrast for low spatial frequencies, but significantly improves the practical imaging resolution to near the incoherent diffraction limit. By incorporating high-numerical aperture (NA) illumination as well as high-NA objective, it is shown, for the first time, that TIE phase imaging can achieve a transverse resolution up to 208 nm, corresponding to an effective NA of 2.66. Time-lapse imaging of in vitro Hela cells revealing cellular morphology and subcellular dynamics during cells mitosis and apoptosis is exemplified. Given its capability for high-resolution QPI as well as the compatibility with widely available brightfield microscopy hardware, the proposed approach is expected to be adopted by the wider biology and medicine community.

研究动机与目标

• 解决使用圆形照明的准相干传输-强度定量相位成像（TIE-QPI）中固有的信噪比-分辨率权衡问题以及低相位对比度问题。
• 在不依赖复杂光学系统或时间相干性的前提下，将TIE-QPI的横向分辨率提升至接近相干衍射极限。
• 实现高保真度、低噪声、非光毒性的长时间活细胞成像，尤其适用于观察有丝分裂和细胞凋亡等动态过程。
• 证明该方法与传统明场显微镜硬件（包括卤素灯和科勒照明）兼容，从而在生物医学研究中实现广泛推广。

提出的方法

• 用环形孔径替代标准圆形照明孔径，以整形照明光源函数并匹配物镜的数值孔径（NA）。
• 利用高数值孔径（NA）油浸物镜与环形照明，实现2.66的有效NA，接近相干衍射极限。
• 采用传输-强度方程（TIE）从多个轴向离焦位置的强度测量中实现定量相位重建。
• 利用部分相干传递函数（WOTF）建模系统响应，其中环形照明优化了频率覆盖范围，从而改善了低频与高频的相位对比度。
• 结合高NA照明与探测，提升分辨率并抑制散斑噪声，实现无散斑、稳定的相位重建。
• 采用时间序列成像，曝光时间为50 ms，帧率为1帧/秒，以捕捉动态细胞过程，并从定量相位图生成相位对比图像与DIC图像。

实验结果

研究问题

• RQ1 与传统圆形照明相比，环形照明是否能显著提升基于TIE的定量相位成像中的相位对比度与分辨率？
• RQ2 在使用具有定制光源分布的准相干照明条件下，TIE-QPI在多大程度上可实现接近相干衍射极限的分辨率？
• RQ3 高NA环形照明的使用如何影响活细胞相位成像中的噪声性能与图像保真度？
• RQ4 AI-TIE是否可无需专用激光器或复杂干涉测量系统，直接在标准明场显微镜上实现？
• RQ5 该方法是否能以高空间分辨率和低光毒性分辨亚细胞动态过程，如有丝分裂与细胞凋亡？

主要发现

• AI-TIE实现了208 nm的横向分辨率，对应有效数值孔径为2.66，为迄今基于TIE的定量相位成像中报道的最高分辨率。
• 该方法显著增强了低空间频率分量的相位对比度，有效抑制了传统TIE成像中常见的低频伪影。
• 相位噪声极低，非细胞区域360次独立测量的标准偏差仅为1.81 pg，表明系统具有高稳定性和低噪声特性。
• 对体外Hela细胞的时间序列成像清晰揭示了有丝分裂和细胞凋亡过程中的形态变化，包括细胞核浓缩、胞浆颗粒化、膜泡状形成及凋亡小体生成。
• 该技术与传统明场显微镜硬件（包括卤素灯和科勒照明）兼容，可在生物医学实验室中广泛部署。
• 当前成像速度受限于机械z轴扫描（1帧/秒），但可通过空间光调制器或电调焦透镜实现视频速率成像。