[论文解读] High Speed Two-Photon Lifetime Imaging

Sebastian Karpf, Bahram Jalali|arXiv (Cornell University)|Sep 2, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用 2

一句话总结

本文提出一种基于波长扫频激光和利用角向色散实现无惯性光束转向的高速双光子寿命成像系统，实现每秒8800万像素的采集速度。该系统在单光子灵敏度下实现千赫兹帧率，支持实时、衍射极限的荧光和FLIM成像，适用于图像辅助细胞分选等高通量应用。

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

研究动机与目标

• 克服传统双光子显微镜因机械扫描器导致的速度限制，其帧率通常被限制在每秒10至100帧。
• 为动态生物过程和高通量应用提供高速、高带宽的荧光寿命成像（FLIM）。
• 开发一种可数字重构的成像系统，具备快速光束转向和高带宽探测能力，以实现前所未有的采集速度。
• 将脉冲调制的快速波长扫频激光与角向色散相结合，实现无惯性光束转向，消除机械扫描延迟。
• 在单光子灵敏度下实现千赫兹帧率，以实现实时、高灵敏度、高分辨率的活细胞和组织寿命成像。

提出的方法

• 采用脉冲调制的快速波长扫频激光，生成重复率高且中心波长可调的激发脉冲。
• 利用角向色散实现无机械部件的光束转向，从而实现无惯性、高速的光束扫描。
• 采用高带宽、单光子灵敏度探测器，以高时间分辨率捕获荧光衰减信号。
• 将扫频激光源与可数字重构的成像系统结合，实现实时、多模态的双光子荧光与FLIM成像。
• 利用能够处理高通量像素速率（每秒8800万像素）的数据采集系统，支持实时寿命分析。
• 利用系统的可重构性，支持静态成像和成像流式细胞术应用。

实验结果

研究问题

• RQ1 波长扫频激光与角向色散能否在无机械扫描的情况下实现双光子显微镜的千赫兹帧率？
• RQ2 在双光子FLIM中，高带宽、单光子灵敏度探测器可实现的最大像素采集速率是多少？
• RQ3 该系统能否在超高速运行下实现衍射极限分辨率和分子特异性？
• RQ4 数字可重构激光与数据采集系统的集成如何实现高通量成像应用（如图像辅助细胞分选）？
• RQ5 当帧率超过每秒100帧时，该系统能否在荧光寿命测量中保持高灵敏度和高时间分辨率？

主要发现

• 该系统实现了每秒8800万像素的创记录采集速度，支持实时、高通量的双光子成像。
• 通过角向色散实现无惯性光束转向并结合快速波长扫频激光，实现了千赫兹帧率，消除了机械扫描的限制。
• 系统支持衍射极限、多模态的双光子荧光与荧光寿命成像（FLIM），具备高灵敏度和高分辨率。
• 高带宽单光子探测实现了在超高速帧率下的精确寿命测量。
• 数字可重构激光与成像系统使系统在静态成像和成像流式细胞术模式下均可灵活运行。
• 该技术通过结合快速采集、分子特异性和亚细胞分辨率，实现了高速图像辅助细胞分选。