[论文解读] In silico design, in vitro construction and in vivo application of synthetic small regulatory RNAs in bacteria

Martin Brueck, Bork A. Berghoff+1 more|arXiv (Cornell University)|Apr 28, 2023

Bacterial Genetics and Biotechnology参考文献 19被引用 4

一句话总结

本文提出了一套简化的流程，用于在细菌中设计、构建和验证合成小调控RNA（sRNA），该流程结合了SEEDling的计算机预测、黄金标准克隆法的体外组装，以及通过表型筛选或荧光报告系统进行的功能验证。该方法成功在*E. coli*中抑制了acrA mRNA的表达，通过增加对氧氟西林的敏感性证实了sRNA的功能性。

ABSTRACT

Small regulatory RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs in bacteria capable of post-transcriptional regulation. sRNAs have recently gained attention as tools in basic and applied sciences for example to fine-tune genetic circuits or biotechnological processes. Even though sRNAs often have a rather simple and modular structure, the design of functional synthetic sRNAs is not necessarily trivial. This protocol outlines how to use computational predictions and synthetic biology approaches to design, construct and validate synthetic sRNA functionality for their application in bacteria. The computational tool, SEEDling, matches the optimal seed region with the user-selected sRNA scaffold for repression of target mRNAs. The synthetic sRNAs are assembled using Golden Gate cloning and their functionality is subsequently validated. The protocol uses the acrA mRNA as an exemplary proof-of-concept target in Escherichia coli. Since AcrA is part of a multidrug efflux pump, acrA repression can be revealed by assessing oxacillin susceptibility in a phenotypic screen. However, in case target repression does not result in a screenable phenotype, an alternative validation of synthetic sRNA functionality based on a fluorescence reporter is described.

研究动机与目标

• 开发一种可靠且模块化的流程，用于在细菌中设计具有功能的合成sRNA。
• 解决尽管sRNA结构简单但其设计仍具挑战性的问题。
• 实现在合成生物学和生物技术应用中精确的转录后基因调控。
• 提供一种经验证的工作流程，使用表型筛选和荧光报告系统作为替代的功能验证方法。

提出的方法

• 利用SEEDling计算工具预测最优的种子区域，使其与用户选定的sRNA支架匹配，以实现对目标mRNA的抑制。
• 通过计算机预测设计具有特定种子序列的合成sRNA构建体，以靶向特定mRNA。
• 使用黄金标准克隆法进行高保真度、模块化且高效的体外构建，组装合成sRNA。
• 将构建体转化至*Escherichia coli*中进行体内表达和功能测试。
• 通过使用氧氟西林敏感性进行表型筛选来验证sRNA功能，因为acrA的抑制会破坏一种多药外排泵。
• 当缺乏明显表型时，使用荧光报告系统作为替代验证方法。

实验结果

研究问题

• RQ1 像SEEDling这样的计算预测工具能否可靠地识别出针对特定mRNA的合成sRNA的功能性种子区域？
• RQ2 黄金标准克隆法是否是一种高效且高保真度地组装合成sRNA的可靠方法？
• RQ3 能否通过使用氧氟西林敏感性进行表型筛选检测到合成sRNA对acrA mRNA的抑制？
• RQ4 当缺乏明显表型输出时，如何验证sRNA的功能性？
• RQ5 荧光报告系统能否作为sRNA验证的可靠替代方法，替代表型筛选？

主要发现

• SEEDling工具成功识别出功能性种子区域，使在*E. coli*中有效抑制acrA mRNA靶标成为可能。
• 黄金标准克隆法实现了合成sRNA基因的高效且精确的体外构建，具有高度模块化和保真度。
• acrA mRNA的抑制导致氧氟西林敏感性增加，通过表型筛选证实了sRNA在功能上的活性。
• 当缺乏表型输出时，荧光报告系统为验证sRNA功能提供了可靠的替代方案。
• 整个工作流程——从计算机设计到体内验证——已成功以acrA作为概念验证靶标得到展示。