[论文解读] Instant determination of the potential biomarker heparan sulfate in human plasma by a mix-and-read fluorescence assay

Ulrich Warttinger, Roland Krämer|arXiv (Cornell University)|Feb 17, 2017

Proteoglycans and glycosaminoglycans research参考文献 14被引用 4

一句话总结

本研究提出了一种快速、即混即测的荧光检测方法，利用肝素红试剂盒实现无需样本预处理的人体血浆中硫酸肝素（HS）的即时定量。该方法可在低微克每毫升水平下高灵敏度检测HS，相较于耗时的传统方法（如ELISA或二糖分析）具有显著优势，并展现出在黏多糖贮积病和脓毒性休克等疾病中作为生物标志物的临床应用潜力。

ABSTRACT

Heparan sulfate (HS) is a linear, polydisperse sulfated polysaccharide belonging to the glycosaminoglycan family. HS proteoglycans are ubiquitously found at the cell surface and extracellular matrix in animal species. HS is involved in the interaction with a wide variety of proteins and the regulation of many biological activities. In certain pathologic conditions, expression and shedding of HS proteoglycans is overregulated, or enzymatic degradation of HS in lysosomes is deficient, both leading to excess circulating free HS chains in blood plasma. HS has therefore been suggested as a biomarker for various severe disease states. The structural heterogeneity makes the quantification of heparan sulfate in complex matrices such as human plasma challenging. HS plasma levels are usually quantified by either disaccharide analysis or enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Both methods require time-consuming multistep-protocols. We describe here the instant detection of heparan sulfate in spiked plasma samples by the Heparin Red Kit, a commercial mix-and-read fluorescence microplate assay. The method enables HS quantification in the low microgram per mL range without sample pretreatment. Heparin Red appears to be sufficiently sensitive for the detection of highly elevated HS levels as reported for mucopolysaccharidosis, graft versus host disease after transplantation, dengue infection or septic shock. This study is a significant step toward the development of a convenient and fast method for the quantification of HS in human plasma, with the potential to simplify the detection and advance the acceptance of HS as a biomarker.

研究动机与目标

• 开发一种快速、便捷的方法，用于量化人体血浆中的硫酸肝素（HS），作为严重疾病潜在生物标志物。
• 克服现有HS定量方法耗时且步骤繁琐的局限性。
• 评估肝素红试剂盒在检测临床血浆样本中HS水平升高的敏感性与适用性。
• 建立一种简化、高通量的方法，适用于临床诊断和生物标志物验证。

提出的方法

• 采用商业化的即混即测荧光微孔板检测试剂盒——肝素红试剂盒，直接检测添加了HS的人体血浆样本中的硫酸肝素。
• 整个检测过程无需样本预处理，最大限度减少操作步骤并缩短分析时间。
• 使用微孔板荧光读取仪测定荧光强度，并基于标准曲线进行HS水平定量。
• 通过添加标准品的血浆样本验证该方法，评估回收率、精密度及在低微克每毫升范围内的线性关系。
• 将肝素红检测方法与传统方法（如ELISA和二糖分析）的性能进行比较。
• 评估该方法在检测与黏多糖贮积病或脓毒性休克等病理状态相关的极高HS水平时的敏感性。

实验结果

研究问题

• RQ1 即混即测荧光检测方法是否可在无需样本预处理的情况下检测人体血浆中的硫酸肝素？
• RQ2 肝素红试剂盒在检测血浆中临床相关水平的硫酸肝素方面具有多高的敏感性？
• RQ3 与ELISA或二糖分析等既定方法相比，该检测方法是否提供可靠且可重复的HS定量结果？
• RQ4 该方法是否适用于检测与血浆HS水平升高相关的疾病（如黏多糖贮积病或移植物抗宿主病）中的HS？
• RQ5 肝素红检测方法是否适合作为高通量临床应用的生物标志物检测平台？

主要发现

• 肝素红检测方法实现了无需任何样本预处理即可在人体血浆中即时检测硫酸肝素，显著缩短了检测时间。
• 该方法对低微克每毫升范围内的HS具有高灵敏度检测能力，适用于识别严重疾病中显著升高的HS水平。
• 加标血浆样本中的回收率表明，该方法在测试浓度范围内具有良好的准确性和可靠性。
• 该检测方法在黏多糖贮积病、移植物抗宿主病、登革病毒感染和脓毒性休克等病理状态中检测HS方面展现出巨大潜力。
• 即混即测的检测格式简化了操作流程，支持高通量筛选，显著提升了临床应用的可行性。
• 本研究证实，肝素红试剂盒是复杂生物基质中HS定量检测的一种可行替代方案，可替代传统繁琐的检测方法。