[论文解读] Leveraging massively parallel reporter assays for evolutionary questions

Irene Gallego Romero, Amanda J. Lea|arXiv (Cornell University)|Apr 12, 2022

Genetic diversity and population structure被引用 6

一句话总结

本文倡导利用大规模并行报告基因分析（MPRAs）来解码非编码调控序列在跨物种进化变化中的作用。通过在单次实验中实现数以千计至数百万个调控序列的高通量功能检测，MPRAs克服了传统方法在可扩展性和在非模式生物中应用方面的局限，为基因组规模的功能进化遗传学提供了一项强大工具。

ABSTRACT

A long-standing goal of evolutionary biology is to decode how gene regulatory processes contribute to organismal diversity, both within and between species. This question has remained challenging to answer, due both to the difficulties of predicting function from non-coding sequence, and to the technological constraints of laboratory research with non-model taxa. However, a recent methodological development in functional genomics, the massively parallel reporter assay (MPRA), makes it possible to test thousands to millions of sequences for regulatory activity in a single in vitro experiment. It does so by combining traditional, single-locus episomal reporter assays (e.g., luciferase reporter assays) with the scalability of high-throughput sequencing. In this perspective, we discuss the execution, advantages, and limitations of MPRAs for research in evolutionary biology. We review recent studies that have made use of this approach to address explicitly evolutionary questions, highlighting study designs that we believe are particularly well-positioned to gain from MPRA approaches. Additionally, we propose solutions for extending these powerful assays to rare taxa and those with limited genomic resources. In doing so, we underscore the broad potential of MPRAs to drive genome-scale functional evolutionary genetics studies in non-traditional model organisms.

研究动机与目标

• 解决在进化生物学中将非编码DNA序列与调控功能关联起来的挑战。
• 克服在基因组资源有限的非模式类群中测试调控元件的技术限制。
• 展示如何将MPRA扩展至全基因组水平，以应对进化研究中的功能分析需求。
• 为在罕见或研究不足的物种中应用MPRA提出切实可行的解决方案。
• 将MPRA定位为非传统模式生物中大规模、功能进化遗传学研究的变革性工具。

提出的方法

• 采用大规模并行报告基因分析（MPRAs），结合游离型报告系统与高通量测序，以检测调控活性。
• 设计包含来自不同物种的数千至数百万个非编码DNA序列的合成文库。
• 将MPRA与下一代测序技术整合，以单次体外实验量化每个序列变体的转录活性。
• 通过利用保守的调控机制和跨物种相容性，将MPRA方案适配于非模式生物。
• 应用生物信息学流程对MPRA测序读数进行归一化处理，并将其解释为调控强度的代理指标。
• 提出在缺乏遗传工具的类群中应用MPRA的策略，包括体外转染和合成启动子设计。

实验结果

研究问题

• RQ1 如何在大规模上对非模式生物的调控序列进行功能测试，以理解其进化作用？
• RQ2 在进化研究中，MPRA实验的关键设计原则是什么，以最大化灵敏度和可重复性？
• RQ3 如何将MPRA适配于基因组和分子资源有限的稀有或研究不足的物种？
• RQ4 MPRA数据在多大程度上可以预测不同进化谱系中的顺式调控活性？
• RQ5 如何将MPRA与比较基因组学整合，以在进化背景下识别具有功能意义的调控元件？

主要发现

• MPRAs可在单次实验中实现数万至数百万个调控序列的功能检测，显著提升了传统报告基因检测的通量。
• MPRA数据在模式系统中与内源性基因表达模式表现出强相关性，验证了其在调控元件预测中的有效性。
• 通过优化转染条件并使用保守的启动子元件，该方法可适配于非模式生物。
• MPRA能够检测跨物种的同源调控序列之间的细微功能差异，揭示基因调控的进化变化。
• 通过将MPRA与比较基因组学结合，研究人员可优先筛选出在进化分析中具有功能意义的非编码变异。
• 作者提出了在基因组和分子资源有限的类群中应用MPRA的可行工作流程，显著拓展了其在非模式系统中的应用范围。