[论文解读] Methods to calibrate and scale axial distances in confocal microscopy as a function of refractive index

Thijs H. Besseling, Jissy Jose+1 more|arXiv (Cornell University)|Apr 15, 2014

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 1被引用 10

一句话总结

本文提出两种实用且精确的方法，通过考虑折射率（RI）不匹配和矢量光效应，校准3D共聚焦显微镜中的轴向距离。利用玻璃腔体中的法布里-珀罗干涉条纹测高法和大尺寸荧光壳微球，作者证明轴向比例因子与RI呈线性关系，且与完整的矢量光理论高度一致——这与几何光学的预测相反——而即使在无RI不匹配的情况下，微米级球体仍因点扩散函数（PSF）效应显著拉长。

ABSTRACT

Accurate distance measurement in 3D confocal microscopy is important for quantitative analysis, volume visualization and image restoration. However, axial distances can be distorted by both the point spread function and by a refractive-index mismatch between the sample and immersion liquid, which are difficult to separate. Additionally, accurate calibration of the axial distances in confocal microscopy remains cumbersome, although several high-end methods exist. In this paper we present two methods to calibrate axial distances in 3D confocal microscopy that are both accurate and easily implemented. With these methods, we measured axial scaling factors as a function of refractive-index mismatch for high-aperture confocal microscopy imaging. We found that our scaling factors are almost completely linearly dependent on refractive index and that they were in good agreement with theoretical predictions that take the full vectorial properties of light into account. There was however a strong deviation with the theoretical predictions using (high-angle) geometrical optics, which predict much lower scaling factors. As an illustration, we measured the point-spread-function of a point-scanning confocal microscope and showed that an index-matched, micron-sized spherical object is still significantly elongated due to this PSF, which confirms that single micron-sized spheres are not well suited to determine accurate axial calibration nor axial scaling.

研究动机与目标

• 解决由于折射率（RI）不匹配和点扩散函数（PSF）畸变导致的共聚焦显微镜中轴向距离测量不准确的问题。
• 克服现有轴向校准方法往往繁琐或不精确的局限性。
• 提供经实验验证、适用于高数值孔径共聚焦显微镜常规使用的实用校准技术。
• 阐明实验测得的轴向比例因子与几何光学预测值之间的差异，以及与矢量光理论预测值的对比。
• 证明即使在无RI不匹配的情况下，微米级球形颗粒也因PSF引起的轴向拉长而不适合作为轴向校准标准。

提出的方法

• 构建基于定制玻璃盖玻片的校准腔室，利用透射光谱中的法布里-珀罗干涉条纹实现亚微米精度的精确测高。
• 在腔室中填充四种折射率匹配的溶剂（掺入荧光染料），以在折射率范围（1.3–1.5）内成像轴向距离。
• 利用干涉条纹测得的轴向比例因子，确定油浸物镜（NA = 1.4）在不同RI下的轴向距离畸变特性。
• 采用大尺寸（≈50 µm直径）荧光壳微球作为第二种校准方法，利用其薄荧光壳减少内部散射，实现精确的轴向测量。
• 在轴向校准前，使用标准校准网格完成横向校准，确保横向分辨率准确。
• 将实验测得的轴向比例因子与基于矢量光学（Sheppard & Török, 1997）和几何光学（Visser et al., 1992）的理论预测进行比较，评估两种模型的有效性。

实验结果

研究问题

• RQ1 在高数值孔径共聚焦显微镜中，样本与浸渍介质之间折射率不匹配时，轴向比例因子如何随折射率变化？
• RQ2 实验测得的轴向校准结果在多大程度上与基于矢量光传播的理论模型一致，而非几何光学模型？
• RQ3 微米级球形颗粒是否可被可靠地用于轴向距离校准，还是即使在无RI不匹配时，其表观形状也因PSF而发生畸变？
• RQ4 有哪些实用、精确且易于实施的方法可用于共聚焦显微镜中的轴向距离校准？
• RQ5 轴向PSF如何影响亚微米颗粒的表观形状，这对3D成像和校准有何影响？

主要发现

• 在折射率范围1.3–1.5内，共聚焦显微镜中的轴向比例因子与折射率（RI）呈近乎线性关系，支持该范围内的经验校准。
• 实验测得的轴向比例因子与矢量光理论（如Sheppard & Török, 1997）高度一致，该理论考虑了完整的电磁场特性；但与基于几何光学的预测存在显著偏差。
• 几何光学模型严重低估轴向比例因子，预测值最高可比实测值低三倍，表明其不适用于高NA系统。
• 即使在无折射率不匹配的情况下，1 µm荧光球体在轴向上仍显著拉长，这表明其因显微镜本身固有的PSF而无法用作轴向校准标准。
• 在玻璃腔体中采用法布里-珀罗干涉法可实现高精度的轴向距离直接测量，适用于不同RI下的精确校准。
• 大尺寸（≈50 µm）荧光壳微球作为校准颗粒非常有效，因其薄荧光壳可最小化内部散射，从而实现精确的轴向距离测量。