[论文解读] Molecular techniques to characterize the invA genes of Salmonella spp. for pathogen inactivation study in composting

Norshuhaila Mohamed Sunar, E.I. Stentiford+2 more|arXiv (Cornell University)|Apr 21, 2014

Salmonella and Campylobacter epidemiology参考文献 18被引用 7

一句话总结

本研究采用针对 invA 基因的 PCR 方法对堆肥过程中的沙门氏菌属接种物进行分子特征分析，即使在低浓度或处于 VBNC 状态下也能确保准确检测。使用可扩增出约 285 bp 片段的种属特异性引物，该方法在堆肥前确认了沙门氏菌的存在；8 天后，病原体水平降至英国 PAS 100 标准以下，证明在实验室规模反应器中有效灭活。

ABSTRACT

The relatively low concentration of pathogen indicators, such Salmonella, in composting sometimes causes a problem with detection when using the conventional techniques. The presence of viable but non-culturable (VBNC) organisms is also a potential problem with Salmonella detection when using conventional techniques. In this study, the molecular approach for organism recognition, known as Polymerase Chain Reaction (PCR), was used for characterisation the Salmonella spp. used as inoculums in composting. This study also provides a better understand about selecting the suitable primer for Salmonella spp. The specificity of the probes and primers at the species level were verified by performing NCBI-BLAST2 (Basic Local Alignment Search Tool). Primers that target the invA gene for Salmonella were selected which produce fragment lengths around 285bp (shown in Figure 1). The Salmonella spp. solutions were tested and proved contained the sequences of invA gene by using several steps of molecular techniques before used it as inoculums in composting. The laboratory scale batch composting reactors were used to examine the inactivation of Salmonella spp. The inoculate solution of Salmonella was prepared by culturing Salmonella enteritidis (ATCC13076) in tryptone broth solution for 24 hours before adding it directly into the compost material. The reduction rate of Salmonella spp. was enumerated by conventional method accordingly to the standard compost guidelines (Figure 2). The laboratory scale study showed that after composting for 8 days the numbers of Salmonella spp. were below the limits in the UK compost standard (PAS 100) which requires the compost to be free of Salmonella spp.

研究动机与目标

• 为克服传统检测方法在堆肥过程中检测沙门氏菌的局限性，如灵敏度低以及无法检测到仍具活力但无法培养（VBNC）的细胞。
• 利用 NCBI-BLAST2 验证 invA 基因引物在种属水平上的特异性。
• 建立一种可靠的分子方法，用于在堆肥实验前确认接种液中沙门氏菌的存在。
• 利用分子方法和传统计数方法评估实验室规模堆肥反应器中沙门氏菌属的灭活动力学。
• 确定堆肥 8 天是否能使病原体水平降至英国 PAS 100 标准以下。

提出的方法

• 使用设计为扩增约 285 bp 片段的种属特异性引物，对 invA 基因进行 PCR 扩增。
• 利用 NCBI-BLAST2 对基因组序列进行引物特异性验证，以确保种属水平检测的准确性。
• 在胰蛋白胨肉汤中培养沙门氏菌肠炎亚种（ATCC13076）24 小时，以制备接种液。
• 通过凝胶电泳和序列分析，利用分子方法确认接种液中 invA 基因的存在。
• 在受控条件下开展实验室规模反应器中的批次堆肥实验。
• 根据 PAS 100 指南，采用传统平板计数法测定沙门氏菌的减少情况。

实验结果

研究问题

• RQ1 针对 invA 基因的 PCR 方法是否能可靠检测堆肥接种物中的沙门氏菌属，即使细胞处于 VBNC 状态或浓度极低？
• RQ2 所选 invA 基因引物在种属水平上的特异性如何？其验证方法是什么？
• RQ3 在实验室规模堆肥过程中，8 天内是否能将沙门氏菌种群减少至低于英国 PAS 100 标准的水平？
• RQ4 invA 基因的分子确认如何提升堆肥过程中病原体灭活研究的可靠性？
• RQ5 分子方法与传统方法的结合在多大程度上提高了堆肥过程中沙门氏菌计数的准确性？

主要发现

• 针对 invA 基因的特异性引物成功从沙门氏菌肠炎亚种扩增出约 285 bp 的片段，证实了接种液中目标基因的存在。
• NCBI-BLAST2 分析表明，所选引物对沙门氏菌属具有特异性，显著降低了与非目标生物的非特异性反应。
• 分子技术证实，沙门氏菌接种液含有 invA 基因，确保了向堆肥反应器中一致且可靠的病原体引入。
• 堆肥 8 天后，沙门氏菌种群水平降至英国 PAS 100 标准要求的检测限以下。
• 分子确认与传统平板计数方法的结合，为堆肥过程中有效灭活病原体提供了有力证据。
• 本研究证明，当传统方法因 VBNC 状态或细胞数量过低而失效时，分子技术（如 PCR）对于堆肥过程中准确追踪病原体至关重要。