[论文解读] Mutations on COVID-19 diagnostic targets

Rui Wang, Yuta Hozumi+2 more|arXiv (Cornell University)|May 5, 2020

SARS-CoV-2 and COVID-19 Research参考文献 7被引用 7

一句话总结

本研究分析了截至2020年5月1日收集的7,818个SARS-CoV-2基因组，揭示了当前使用的诊断靶点中广泛存在的突变，特别是在核衣壳（N）基因的引物和探针中。研究结果表明，N基因中的突变——尤其是N-China-F试剂中的突变——已严重影响全球诊断的准确性，凸显了未来诊断、疫苗和治疗药物开发中应优先选择更保守的病毒基因的必要性。

ABSTRACT

Effective, sensitive, and reliable diagnostic reagents are of paramount importance for combating the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic at a time there is no preventive vaccine nor specific drug available for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). It would be an absolute tragedy if currently used diagnostic reagents are undermined in any manner. Based on the genotyping of 7818 SARS-CoV-2 genome samples collected up to May 1, 2020, we reveal that essentially all of the current COVID-19 diagnostic targets have had mutations. We further show that SARS-CoV-2 has the most devastating mutations on the targets of various nucleocapsid (N) gene primers and probes, which have been unfortunately used by countries around the world to diagnose COVID-19. Our findings explain what has seriously gone wrong with a specific diagnostic reagent made in China. To understand whether SARS-CoV-2 genes have mutated unevenly, we have computed the mutation ratio and mutation $h$-index of all SARS-CoV genes, indicating that the N gene is the most non-conservative gene in the SARS-CoV-2 genome. Our findings enable researchers to target the most conservative SARS-CoV-2 genes and proteins for the design and development of COVID-19 diagnostic reagents, preventive vaccines, and therapeutic medicines.

研究动机与目标

• 评估SARS-CoV-2突变对当前使用的诊断试剂的影响，特别是针对N基因的试剂。
• 识别最容易发生突变的病毒基因和蛋白，从而影响诊断的可靠性。
• 评估广泛使用的诊断引物和探针集（包括美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织的试剂）在新型病毒变异下的表现。
• 按保守性对SARS-CoV-2基因进行排序，以指导未来诊断、疫苗和治疗药物的开发。
• 通过将其靶区突变率与试剂效率关联，解释特定中国产诊断试剂失败的原因。

提出的方法

• 从GISAID收集了7,818个完整的SARS-CoV-2基因组序列，时间范围为2020年1月5日至5月1日。
• 使用Clustal Omega进行多序列比对，以识别相对于武汉参考株（NC_004718）的单核苷酸多态性（SNPs）。
• 应用k均值聚类，基于SNP谱的Jaccard距离将病毒基因组分为五个不同的亚型（I–V）。
• 计算各基因特异性突变比率（每基因长度的SNPs数），并引入一种新型的突变h指数，以量化突变频率和聚集程度。
• 将所有识别出的5,117个SNPs映射到41种常用诊断引物和探针组中，评估突变频率及其对靶标结合的影响。
• 使用统计分析比较不同病毒基因间的突变模式，并将其与诊断试剂性能相关联。

实验结果

研究问题

• RQ1 目前用于诊断引物和探针的SARS-CoV-2基因中，突变的普遍程度如何？
• RQ2 哪些SARS-CoV-2基因表现出最高的突变率，因此最不适合作为诊断靶点？
• RQ3 N基因中的突变，特别是N-China-F试剂中的突变，在多大程度上解释了某些诊断试剂效率低下的原因？
• RQ4 突变h指数和突变比率指标能否可靠地识别出最保守的病毒基因，以用于疫苗和治疗药物的开发？
• RQ5 不同全球地区和病毒谱系中，突变的分布和频率有何差异？

主要发现

• 在7,818个SARS-CoV-2基因组中，共鉴定出5,117个单核苷酸多态性（SNPs），突变分布于所有病毒基因中。
• 核衣壳（N）基因表现出最高的突变比率（0.2705）和最大的突变h指数（29），表明其为最不保守且最易发生突变的基因。
• 在中国使用的N-China-F诊断试剂，在所有五个病毒簇中均存在八个突变，解释了其在临床检测中报告的无效性。
• 美国疾病控制与预防中心（CDC）的N1和N2引物/探针组，虽在全球广泛使用，但也受到突变的显著影响，威胁到RT-PCR诊断的可靠性。
• ORF3a和ORF8蛋白的突变比率分别位居第二（0.2800和0.2479），表明其具有高度变异性。
• N基因的高突变率及由此导致的引物/探针不匹配，已严重削弱全球诊断检测工作，亟需重新评估诊断和疫苗开发中的靶点选择。