[论文解读] Nanopore Sequencing of the phi X 174 genome

Andrew H. Laszlo, Ian M. Derrington+11 more|arXiv (Cornell University)|Jun 17, 2014

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 1被引用 3

一句话总结

本研究展示了利用MspA纳米孔对噬菌体φX 174基因组进行长读长、单分子纳米孔测序，通过将离子电流水平映射到全部256种可能的四核苷酸序列（四聚体）中，实现了长达4,500个碱基的读长无歧义比对。四聚体图谱可准确预测新序列的电流水平，从而在杂合基因组组装和多态性检测方面实现概念验证应用，具有高准确度和极少的样本制备要求。

ABSTRACT

Nanopore sequencing of DNA is a single-molecule technique that may achieve long reads, low cost, and high speed with minimal sample preparation and instrumentation. Here, we build on recent progress with respect to nanopore resolution and DNA control to interpret the procession of ion current levels observed during the translocation of DNA through the pore MspA. As approximately four nucleotides affect the ion current of each level, we measured the ion current corresponding to all 256 four-nucleotide combinations (quadromers). This quadromer map is highly predictive of ion current levels of previously unmeasured sequences derived from the bacteriophage phi X 174 genome. Furthermore, we show nanopore sequencing reads of phi X 174 up to 4,500 bases in length that can be unambiguously aligned to the phi X 174 reference genome, and demonstrate proof-of-concept utility with respect to hybrid genome assembly and polymorphism detection. All methods and data are made fully available.

研究动机与目标

• 开发一种高精度的纳米孔测序方法，实现长读长、单分子DNA分析，且样本制备极少。
• 建立MspA纳米孔中所有256种四核苷酸组合对应的离子电流水平的完整四聚体图谱。
• 通过φX 174参考基因组展示纳米孔测序在准确基因组比对、杂合组装和多态性检测方面的可行性。

提出的方法

• 使用MspA纳米孔监测DNA穿过孔道时的离子电流变化。
• 测量并校准所有256种可能的四核苷酸序列（四聚体）的离子电流水平，以建立预测性电流图谱。
• 利用四聚体图谱根据DNA在穿孔过程中的特征电流水平解码未知DNA序列。
• 从φX 174基因组生成长达4,500个碱基的纳米孔测序读长，并将其与参考序列比对。
• 通过展示长读长的无歧义比对和已知多态性的检测，验证了该方法的准确性。
• 公开所有实验方法、数据及补充材料，以支持可重复性与进一步开发。

实验结果

研究问题

• RQ1 基于四聚体的离子电流图谱是否能够实现在纳米孔穿孔过程中对DNA序列的准确解码？
• RQ2 在利用电流水平特征信号的情况下，长纳米孔读长（最长可达4,500个碱基）在多大程度上能与参考基因组实现无歧义比对？
• RQ3 采用此方法的纳米孔测序是否能够以高保真度支持杂合基因组组装和多态性检测？
• RQ4 四聚体图谱对先前未测量的DNA序列的离子电流水平具有多大预测能力？
• RQ5 该方法是否能在极少样本制备和低成本仪器条件下实现高精度？

主要发现

• 四聚体图谱对新DNA序列的离子电流水平实现了高精度预测，从而实现了可靠的序列解码。
• 纳米孔测序产生了长达4,500个碱基的读长，可与φX 174参考基因组实现无歧义比对。
• 该方法在杂合基因组组装中展示了概念验证的实用性，表明其与现有组装流程兼容。
• 成功实现了多态性检测，证实了该方法对参考序列中已知遗传变异的敏感性。
• 所有实验数据、方法和补充材料均已完全公开，以支持可重复性与进一步研究。