[论文解读] Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements - a worldwide benchmark study

Björn Hellenkamp, Sonja Schmid+51 more|arXiv (Cornell University)|Oct 10, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用 13

一句话总结

这项全球基准研究评估了20个实验室使用标准化标记染料的DNA双链体对单分子FRET（smFRET）测量的精确度和准确性。研究显示，FRET效率的测量标准差为±0.02至±0.05，并提供了一种经过验证的协议，通过使用校正后的光物理参数将FRET效率转换为精确距离，显著提高了smFRET在结构生物学研究中的可重复性和可靠性。

ABSTRACT

Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is increasingly being used to determine distances, structures, and dynamics of biomolecules in vitro and in vivo. However, generalized protocols and FRET standards ensuring both the reproducibility and accuracy of measuring FRET efficiencies are currently lacking. Here we report the results of a worldwide, comparative, blind study, in which 20 labs determined the FRET efficiencies of several dye-labeled DNA duplexes. Using a unified and straightforward method, we show that FRET efficiencies can be obtained with a standard deviation between $Δ$E = +-0.02 and +-0.05. We further suggest an experimental and computational procedure for converting FRET efficiencies into accurate distances. We discuss potential uncertainties in the experiment and the modelling. Our extensive quantitative assessment of intensity-based smFRET measurements and correction procedures serve as an essential step towards validation of distance networks with the ultimate aim to archive reliable structural models of biomolecular systems obtained by smFRET-based hybrid methods.

研究动机与目标

• 评估多个独立实验室内smFRET测量的可重复性和准确性。
• 识别并量化基于强度的smFRET测量中的关键不确定性来源。
• 建立一种标准化、普遍适用的协议，通过使用校正后的光物理参数将FRET效率转换为精确距离。
• 提供一个经过验证的框架，以提高smFRET在生物分子结构与动态研究中的可靠性。

提出的方法

• 开展了一项涉及20个独立实验室的全球性盲比对研究，使用完全相同的染料标记DNA双链体。
• 采用统一、简便的方法，从供体和受体光子计数计算FRET效率。
• 对光物理参数（包括量子产率ΦD、供体和受体消光系数εD、εA、光谱重叠J以及取向因子κ²）应用校正程序。
• 利用时间分辨荧光各向异性测量评估转动平均效应，并在快速染料转动条件下验证κ² = 2/3。
• 通过误差传播方法计算各参数的不确定性贡献，总Förster半径R0的不确定性估计不超过R0的7%。
• 通过β因子网络的一致性检查和与模型距离的比较，对结果进行验证。

实验结果

研究问题

• RQ1 在使用标准化样品的多样化实验室中，smFRET效率测量的可重复性如何？
• RQ2 光物理参数（ΦD、εD、εA、J、κ²）的不确定性在多大程度上影响smFRET中距离计算的准确性？
• RQ3 实验和建模假设（例如，偶极子方向各向同性、染料位置固定）在多大程度上影响FRET距离的准确性？
• RQ4 标准化校正协议在多大程度上能显著降低smFRET距离测量的变异性并提高准确性？

主要发现

• 在20个实验室中，FRET效率的测量标准差为±0.02至±0.05，显示出高度可重复性。
• Förster半径R0的不确定性估计不超过R0的7%，主要贡献来自κ²（±5%）、J（±2.5%）、ΦD（±2%）和εA（±2%）。
• 当稳态荧光各向异性值低于0.2时，各向同性偶极子取向假设（κ² = 2/3）得到验证，表明转动平均充分。
• 时间分辨各向异性测量证实，转动相关时间足够快，可合理假设κ² = 2/3，残余各向异性值小于0.1。
• 使用经过充分表征的染料（如Atto647N）可降低不确定性，且该协议在不同实验设置下均表现出稳健性。
• 本研究提供了一个经过验证、普遍适用的框架，用于实现精确的smFRET距离测量，对混合结构建模至关重要。