[论文解读] Rapid and Accurate Detection of SARS-CoV-2 Mutations using a Cas12a-based Sensing Platform

Cai He, Chung‐Chih Lin+15 more|arXiv (Cornell University)|Oct 25, 2021

CRISPR and Genetic Engineering参考文献 11被引用 4

一句话总结

本研究提出RT-CORDS，一种基于Cas12a的CRISPR检测平台，可在RT-PCR后10分钟内实现对关键SARS-CoV-2刺突蛋白突变（如N501Y、D614G、69/70缺失）的快速、灵敏且特异的检测，采用荧光或侧向流动检测读出方式。该方法与测序相比准确率达100%，检测限为6 copies/μL（10⁻¹⁷ M），是一种可扩展的临床变异株监测工具。

ABSTRACT

The increasing prevalence of SARS-CoV-2 variants with spike mutations has raised concerns owing to higher transmission rates, disease severity, and escape from neutralizing antibodies. Rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 variants provides crucial information concerning the outbreaks of SARS-CoV-2 variants and possible lines of transmission. This information is vital for infection prevention and control. We used a Cas12a-based RT-PCR combined with CRISPR on-site rapid detection system (RT-CORDS) platform to detect the key mutations in SARS-COV-2 variants, such as 69/70 deletion, N501Y, and D614G. We used type-specific CRISPR RNAs (crRNAs) to identify wild-type (crRNA-W) and mutant (crRNA-M) sequences of SARS-CoV-2. We successfully differentiated mutant variants from wild-type SARS-CoV-2 with a sensitivity of $10^{-17}$ M (approximately 6 copies/$μ$L). The assay took just 10 min with the Cas12a/crRNA reaction after a simple RT-PCR using a fluorescence reporting system. In addition, a sensitivity of $10^{-16}$ M could be achieved when lateral flow strips were used as readouts. The accuracy of RT-CORDS for SARS-CoV-2 variant detection was 100% consistent with the sequencing data. In conclusion, using the RT-CORDS platform, we accurately, sensitively, specifically, and rapidly detected SARS-CoV-2 variants. This method may be used in clinical diagnosis.

研究动机与目标

• 开发一种快速、准确且可扩展的方法，用于检测新兴变异株中临床相关的SARS-CoV-2刺突蛋白突变。
• 应对迫切需求，提供一种可在现场实时区分野生型与突变型SARS-CoV-2毒株的即时检测诊断方法。
• 通过提供一种低成本、高特异性且适用于现场使用的检测平台，实现实时疫情追踪和感染控制。

提出的方法

• RT-CORDS平台结合逆转录（RT）与基于CRISPR-Cas12a的检测技术，使用针对野生型（crRNA-W）和突变型（crRNA-M）SARS-CoV-2序列的特异性crRNA。
• Cas12a经crRNA编程后，可在靶标结合后识别并切割报告探针，实时生成荧光信号。
• 该系统采用荧光检测系统实现定量检测，或使用侧向流动条带实现资源有限环境下的可视化读出。
• 该方法在标准RT-PCR扩增步骤后应用，确保高灵敏度和高特异性。
• 检测依赖于活化Cas12a的旁切活性，实现信号放大和极低的检测限。

实验结果

研究问题

• RQ1 基于CRISPR-Cas12a的平台是否能在快速检测格式下实现对关键SARS-CoV-2刺突蛋白突变的高灵敏度与高特异性检测？
• RQ2 RT-CORDS平台在变异株检测中的准确性与金标准Sanger测序相比如何？
• RQ3 使用荧光和侧向流动检测读出方式时，该平台对突变型SARS-CoV-2序列的检测限是多少？
• RQ4 该平台是否可适配为仅需最少设备和培训的即时检测应用？

主要发现

• 采用荧光读出方式时，RT-CORDS平台的检测限为10⁻¹⁷ M（约6 copies/μL），显示出极高的灵敏度。
• 采用侧向流动条带读出方式时，检测限为10⁻¹⁶ M，表明其在视觉检测格式中具有优异的性能。
• 该方法与Sanger测序数据完全一致，证实其在区分野生型与突变型SARS-CoV-2毒株方面具有极高的准确性。
• 在完成RT-PCR后，变异株检测可在10分钟内完成，实现临床和公共卫生应用的快速周转。
• 该平台成功利用突变特异性crRNA区分了包括N501Y、D614G和69/70缺失在内的关键突变。