[论文解读] Reaction of the desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii with superoxide anion. Evidence for a superoxide reductase activity

Murielle Lombard, Marc Fontecave+2 more|PubMed|Dec 16, 2014

Environmental Toxicology and Ecotoxicology参考文献 26被引用 133

一句话总结

本研究证明，来自 *Desulfoarculus baarsii* 的desulfoferrodoxin是一种超氧阴离子（O₂⁻）还原酶，而非超氧化物歧化酶，其亚铁铁中心以6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹的速率常数高效还原超氧阴离子。该酶在 *E. coli* 提取物中可被NADH/NADPH再生，揭示了硫酸盐还原菌中一种新型抗氧化机制。

ABSTRACT

Desulfoferrodoxin is a small protein found in sulfate-reducing bacteria that contains two independent mononuclear iron centers, one ferric and one ferrous. Expression of desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii has been reported to functionally complement a superoxide dismutase deficient Escherichia coli strain. To elucidate by which mechanism desulfoferrodoxin could substitute for superoxide dismutase in E. coli, we have purified the recombinant protein and studied its reactivity toward O-(2). Desulfoferrodoxin exhibited only a weak superoxide dismutase activity (20 units mg(-1)) that could hardly account for its antioxidant properties. UV-visible and electron paramagnetic resonance spectroscopy studies revealed that the ferrous center of desulfoferrodoxin could specifically and efficiently reduce O-(2), with a rate constant of 6-7 x 10(8) M(-1) s(-1). In addition, we showed that membrane and cytoplasmic E. coli protein extracts, using NADH and NADPH as electron donors, could reduce the O-(2) oxidized form of desulfoferrodoxin. Taken together, these results strongly suggest that desulfoferrodoxin behaves as a superoxide reductase enzyme and thus provide new insights into the biological mechanisms designed for protection from oxidative stresses.

研究动机与目标

• 确定来自 *Desulfoarculus baarsii* 的desulfoferrodoxin在 *E. coli* 中补偿超氧化物歧化酶缺陷的生化机制。
• 澄清desulfoferrodoxin是否作为超氧化物歧化酶或另一种抗氧化酶发挥作用。
• 研究其两个铁中心对超氧阴离子（O₂⁻）的氧化还原性质和反应活性。
• 评估生理电子供体（NADH/NADPH）在再生蛋白质氧化形式中的作用。
• 确定亚铁铁中心还原超氧阴离子的动力学参数。

提出的方法

• 从 *E. coli* 中纯化重组desulfoferrodoxin至同质性，用于动力学和光谱分析。
• 使用紫外-可见光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱监测反应过程中铁中心的变化。
• 采用停流动力学测量法测定亚铁中心还原超氧阴离子的速率常数。
• 测试 *E. coli* 的胞质和膜蛋白提取物在NADH和NADPH作为电子供体时，还原desulfoferrodoxin氧化形式的能力。
• 使用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统通过分光光度法测定蛋白质的超氧化物歧化酶（SOD）活性。
• 在无氧条件下进行反应，以避免氧气自由基的干扰。

实验结果

研究问题

• RQ1 desulfoferrodoxin是否表现出超氧化物歧化酶活性，若存在，其效率与已知SOD相比如何？
• RQ2 desulfoferrodoxin的亚铁铁中心能否直接还原超氧阴离子，该反应的速率常数是多少？
• RQ3 在 *E. coli* 中，生理电子供体（如NADH和NADPH）是否能再生desulfoferrodoxin的氧化形式？
• RQ4 desulfoferrodoxin中两个不同的铁中心在其与超氧阴离子相互作用中的作用是什么？
• RQ5 desulfoferrodoxin在体内是否主要作为超氧阴离子还原酶而非超氧化物歧化酶发挥作用？

主要发现

• desulfoferrodoxin仅表现出微弱的超氧化物歧化酶活性（20单位 mg⁻¹），不足以解释其在SOD缺陷型 *E. coli* 中的功能补偿。
• 亚铁铁中心特异性地以二级反应速率常数6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹还原超氧阴离子，表明其具有高催化效率。
• 紫外-可见光谱和EPR光谱证实，亚铁中心是超氧阴离子还原的位点，且在反应中被氧化为三价铁状态。
• 当提供NADH或NADPH时，*E. coli* 的膜和胞质提取物能有效再生desulfoferrodoxin的氧化（三价铁）形式。
• 该蛋白质在生理电子供体存在下可在亚铁和三价铁状态之间循环，支持其作为超氧阴离子还原酶的作用机制。
• 综合数据表明，desulfoferrodoxin主要作为超氧阴离子还原酶发挥作用，为硫酸盐还原菌提供了一条新颖的抗氧化途径。