[论文解读] Reducing Photobleaching in STED Microscopy with Higher Scanning Speed

Yong Wu|arXiv (Cornell University)|Aug 7, 2014

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用 1

一句话总结

本研究证明，在共振扫描STED显微镜中提高扫描速度可显著减少光漂白并增强荧光产率，尤其在高耗尽激光强度下效果明显。当视场扩大8倍时，在耗尽激光辐照强度 >0.2 GW·cm⁻² 的条件下，Atto 647N染料的荧光存活时间提高了约80%，证实光漂白主要由耗尽激光作用于激发态荧光分子引起。

ABSTRACT

Photobleaching is a major limitation of superresolution Stimulated Depletion Emission (STED) microscopy. Fast scanning has long been considered an effective means to reduce photobleaching in fluorescence microscopy, but a careful quantitative study of this issue is missing. In this paper, we show that the photobleaching rate in STED microscopy is slowed down and fluorescence yield is enhanced by scanning with high linear speed, enabled by the large field of view in our custom-built resonant-scanning STED microscope. The effect of scanning speed on photobleaching and fluorescence yield is more remarkable at higher levels of depletion laser irradiance, and virtually disappears in conventional confocal microscopy. With a depletion irradiance of >0.2 GW$\cdot$cm$^{-2}$ (time average), we were able to extend the fluorescence survival time of the Atto 647N dye by ~80% with an 8-fold wider field of view. We confirm that STED Photobleaching is primarily caused by the depletion light acting upon the excited fluorophores. Experimental data agree with a theoretical model. Our results encourage further increasing linear scanning speed for photobleaching reduction in STED microscopy.

研究动机与目标

• 研究扫描速度对超分辨成像中主要限制因素——光漂白的影响。
• 确定更快的扫描是否通过缩短荧光分子暴露于耗尽激光的时间来减少光漂白。
• 量化扫描速度、视场与不同耗尽激光强度下荧光存活率之间的关系。
• 通过STED中光漂白动力学的理论模型验证实验结果。
• 确立STED中的光漂白主要由耗尽激光作用于激发态荧光分子引起。

提出的方法

• 采用自建的共振扫描STED显微镜，配合大视场以实现高线性扫描速度。
• 通过调节视场改变扫描速度，同时保持激光功率和成像条件一致。
• 在不同扫描速度和耗尽激光辐照强度下，测量荧光强度随时间的衰减。
• 利用Atto 647N标记样品的时间序列成像，量化光漂白速率和荧光存活时间。
• 建立并应用理论模型，描述脉冲耗尽激发下的光漂白动力学。
• 对比不同扫描速度和耗尽强度下的结果，包括有无共聚焦检测的情况。

实验结果

研究问题

• RQ1 提高扫描速度是否能减少STED显微镜中的光漂白？若能，减少幅度如何？
• RQ2 扫描速度对光漂白的影响如何随耗尽激光辐照强度的增加而变化？
• RQ3 STED显微镜中的光漂白是否主要由耗尽激光作用于激发态荧光分子引起？
• RQ4 在高速扫描下，视场大小在多大程度上影响光漂白速率？
• RQ5 实验结果与脉冲耗尽激发下光漂白理论模型的吻合程度如何？

主要发现

• 提高扫描速度显著减少了STED显微镜中的光漂白，尤其在高耗尽激光强度下效果明显。
• 当视场扩大8倍时，在平均耗尽激光辐照强度 >0.2 GW·cm⁻² 的条件下，Atto 647N染料的荧光存活时间提高了约80%。
• 光漂白减少效果在高耗尽强度下最为显著，而在传统共聚焦显微镜中可忽略不计。
• 实验数据强烈支持一种理论模型，即光漂白主要由耗尽激光作用于激发态荧光分子引起。
• 荧光产率的提升和光漂白的减少直接归因于更快的扫描速度，从而最小化了荧光分子暴露于耗尽光束的时间。
• 结果表明，进一步提高线性扫描速度是减少STED显微镜中光漂白的可行且有效策略。