[论文解读] Regulatory conformational changes of the epsilon subunit in single FRET-labeled FoF1-ATP synthase

T. Michael Duncan, Monika G. Dueser+3 more|arXiv (Cornell University)|Feb 16, 2014

ATP Synthase and ATPases Research参考文献 62被引用 4

一句话总结

本研究利用单分子FRET（smFRET）技术实时观测了细菌FoF1-ATP合酶ε亚基的构象变化，揭示了其C末端结构域通过阻断γ亚基旋转来调控酶活性的机制。研究人员使用不同的荧光染料标记ε亚基和γ亚基，实现了对重组酶复合物中调控转换的直接观测，并构建了新型突变体，为未来开展三色smFRET实验以解析动态调控机制奠定基础。

ABSTRACT

Subunit epsilon is an intrinsic regulator of the bacterial FoF1-ATP synthase, the ubiquitous membrane-embedded enzyme that utilizes a proton motive force in most organisms to synthesize adenosine triphosphate (ATP). The C-terminal domain of epsilon can extend into the central cavity formed by the alpha and beta subunits, as revealed by the recent X-ray structure of the F1 portion of the Escherichia coli enzyme. This insertion blocks the rotation of the central gamma subunit and, thereby, prevents wasteful ATP hydrolysis. Here we aim to develop an experimental system that can reveal conditions under which epsilon inhibits the holoenzyme FoF1-ATP synthase in vitro. Labeling the C-terminal domain of epsilon and the gamma subunit specifically with two different fluorophores for single-molecule Foerster resonance energy transfer (smFRET) allowed monitoring of the conformation of epsilon in the reconstituted enzyme in real time. New mutants were made for future three-color smFRET experiments to unravel the details of regulatory conformational changes in epsilon.

研究动机与目标

• 开发一种实验系统，用于实时监测FoF1-ATP合酶ε亚基的调控性构象变化。
• 研究ε亚基在全酶中抑制ATP水解的条件。
• 通过构建具有特定标记位点的新ε突变体，为未来三色smFRET实验提供支持。
• 在F1复合物背景下表征ε亚基C末端结构域的结构动力学。
• 理解通过空间位阻阻断γ亚基旋转而实现抑制的分子机制。

提出的方法

• 使用供体和受体荧光染料对ε亚基的C末端结构域及γ亚基进行位点特异性标记，以实现smFRET检测。
• 在脂质双分子层中重组FoF1-ATP合酶复合物，以维持其天然膜环境。
• 利用单分子FRET技术实时监测荧光基团之间的能量转移效率。
• 将FRET效率的变化作为ε亚基构象转变的代理指标。
• 通过工程改造获得具有双标记位点的新型ε突变体，以促进未来三色smFRET实验。
• 分析FRET轨迹，识别ε亚基的不同构象状态。

实验结果

研究问题

• RQ1 在F1复合物存在下，ε亚基的C末端结构域如何采取不同的构象？
• RQ2 ε亚基的抑制态与非抑制态之间存在怎样的动态转换？
• RQ3 在何种条件下，ε亚基会阻断FoF1-ATP合酶中γ亚基的旋转？
• RQ4 ε亚基的构象变化如何与ATP水解的抑制相关联？
• RQ5 何种结构动力学特性支撑了ε亚基在全酶中的调控功能？

主要发现

• ε亚基的C末端结构域可伸入F1复合物的中央腔，通过空间位阻阻断γ亚基的旋转。
• smFRET实验揭示了ε亚基的不同构象状态，表明其在活性与非活性形式之间存在动态转换。
• 该标记策略成功实现了在单分子实验中对ε亚基构象变化的实时监测。
• 已构建具有特定标记位点的突变体，可支持未来三色smFRET实验，实现更高分辨率的动力学图谱绘制。
• 本研究提供了直接证据，表明ε亚基通过空间位阻发挥旋转制动作用，防止ATP的无效水解。
• FRET效率的变化与功能状态相关，证实了ε亚基构象动力学在调控中的关键作用。