[论文解读] Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy (SFCS) with a Scan Path Perpendicular to the Membrane Plane

Paul Müller, Petra Schwille+1 more|arXiv (Cornell University)|May 31, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 14被引用 10

一句话总结

本文提出了一种平台无关的开源软件流程（PyScanFCS 和 PyCorrFit），用于在巨型单层囊泡（GUVs）中实现垂直于膜平面的扫描荧光相关光谱（SFCS）。通过在测量后对 kHz 频率扫描的光子轨迹进行对齐与相关分析，该方法克服了传统 FCS 在膜研究中因运动引起的伪影和光漂白等局限性，实现了在更高稳定性和信噪比下对脂质双分子层中扩散系数和分子相互作用的精确测量。

ABSTRACT

Scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS) with a scan path perpendicular to the membrane plane was introduced to measure diffusion and interactions of fluorescent components in free standing biomembranes. Using a confocal laser scanning microscope (CLSM) the open detection volume is moved laterally with kHz frequency through the membrane and the photon events are continuously recorded and stored in a file. While the accessory hardware requirements for a conventional CLSM are minimal, data evaluation can pose a bottleneck. The photon events must be assigned to each scan, in which the maximum signal intensities have to be detected, binned, and aligned between the scans, in order to derive the membrane related intensity fluctuations of one spot. Finally, this time-dependent signal must be correlated and evaluated by well known FCS model functions. Here we provide two platform independent, open source software tools (PyScanFCS and PyCorrFit) that allow to perform all of these steps and to establish perpendicular SFCS in its one- or two-focus as well as its single- or dual-colour modality.

研究动机与目标

• 解决在研究动态生物膜时，传统单点 FCS 所面临的运动引起的伪影和光漂白问题。
• 通过垂直扫描实现对巨型单层囊泡（GUVs）中膜扩散和蛋白质相互作用的高精度测量。
• 提供一种强大、开源且平台无关的 SFCS 数据分析流程，适用于垂直扫描路径。
• 支持单焦点与双焦点、单色与双色 SFCS 模式，适用于多样化的膜生物物理学应用。

提出的方法

• 利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）执行垂直于膜平面的 kHz 频率横向扫描，并通过时间相关单光子计数（TCSPC）记录光子事件。
• 使用 PyScanFCS 通过光子到达时间的快速傅里叶变换（FFT）检测扫描周期时间，并将多轮扫描的强度轨迹对齐生成kymograph以供可视化。
• 通过分箱处理和光漂白校正，提取沿扫描路径的膜特异性强度波动。
• 采用多 τ 算法从对齐后的轨迹中计算时间相关的强度波动。
• 使用 PyCorrFit 将相关曲线拟合至标准 FCS 模型函数，以提取扩散时间、扩散系数和粒子数。
• 支持用户自定义模型函数，并可对共享参数的多组数据进行全局拟合。

实验结果

研究问题

• RQ1 通过测量后扫描轨迹对齐，垂直 SFCS 是否能有效减少 GUV 中因膜运动和漂移引起的伪影？
• RQ2 与传统单点 FCS 相比，垂直 SFCS 在膜系统中的信噪比和测量时长表现如何？
• RQ3 像 PyScanFCS 和 PyCorrFit 这类开源软件工具在多实验室中能在多大程度上实现可重复且可访问的 SFCS 分析？
• RQ4 使用 Alexa 488 溶液校准标准时，垂直 SFCS 测定扩散系数的准确性如何？
• RQ5 能否通过这种垂直扫描方法可靠地实现双色 SFCS，以研究膜中的蛋白质-蛋白质相互作用？

主要发现

• 该方法通过测量后对齐扫描轨迹，成功减轻了 GUV 中由运动引起的伪影，即使在囊泡移动或形状变化的情况下也能实现可靠的关联分析。
• 垂直 SFCS 通过在扫描周期的大部分时间内将激光焦点保持在膜外，减少了光漂白，从而提高了长时间测量的信号稳定性。
• 在 22°C 的 10 mM Tris 缓冲液中，Alexa 488 的扩散系数测定为 (4.35 ± 0.1) × 10⁻¹⁰ m²/s，可作为可靠的校准标准。
• 通过光子到达时间的 FFT 确定的扫描周期时间可能与 LSM 软件设定的标称值不同，因此需要进行经验验证。
• PyCorrFit 能够对相关数据进行稳健拟合，适用于标准 FCS 模型，包括跨多组数据的共享参数全局拟合。
• 该软件流程支持用户自定义模型函数，显著增强了对复杂膜动力学进行高级分析的灵活性。