[论文解读] Sequencing single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 platform

Johanna L. A. Paijmans, Sina Baleka+5 more|arXiv (Cornell University)|Nov 29, 2017

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 1被引用 34

一句话总结

本文通过推荐2.2 pM上样浓度和高达250 k/mm²的簇密度，优化了Illumina NextSeq 500平台上单链DNA文库的测序流程，该方法在保持高数据质量（>80%过滤通过率）的同时提升了产量。研究引入了一款定制的索引读取2号引物（Gesaffelstein），并强调使用Qubit和Tapestation进行精确的文库定量，以确保结果的一致性。

ABSTRACT

Single-stranded libraries generated from ancient DNA extracts have specific sequencing requirements. The short library molecules typically associated with ancient DNA templates are expected to behave differently during the annealing to the flow cell and subsequent cluster generation (bridge PCR), requiring optimisation of loading amounts to obtain optimal and consistent cluster densities. For the past 3 years, we have carried out sequencing of single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 sequencing platform at the Institute for Biochemistry and Biology, University of Potsdam. We report our optimisations here. This document may be useful for other researchers wishing to sequence single-stranded libraries on the NextSeq 500 platform. It does not replace the excellent documentation provided by Illumina (links provided below), but rather serves as additional information specific to single-stranded libraries. The original papers describing the library protocol should also be studied in detail, and complement the information presented here.

研究动机与目标

• 解决在NextSeq 500平台上测序单链DNA文库时簇产量低且数据质量不一致的挑战。
• 在单链文库的默认推荐值之外，优化上样浓度和簇密度。
• 开发并验证一款用于双重索引单链文库的定制索引读取2号测序引物（Gesaffelstein）。
• 建立一种可靠且可重复的文库定量方法，使用Qubit和Tapestation，无需qPCR。
• 为研究人员在NextSeq 500平台上测序古DNA或降解DNA样本提供实用且经过验证的工作流程。

提出的方法

• 为双重索引单链文库使用定制的5’-3’序列（Gesaffelstein：GGA AGA GCG TCG TGT AGG GAA AGA GTG T）作为索引读取2号测序引物。
• 采用2.2 pM的上样浓度——高于Illumina推荐的1.8 pM——以改善短单链DNA模板的簇形成。
• 将簇密度优化至250 k/mm²，超过Illumina推荐的129–165 k/mm²，且数据质量下降可忽略。
• 使用Qubit HS DNA Assay（≥10 µL）和Agilent Tapestation的D1000 High-Sensitivity ScreenTape对文库浓度进行定量，并估算典型片段长度。
• 基于典型片段长度和Qubit浓度计算摩尔浓度，避免使用qPCR进行文库混合。
• 使用Qubit BR Assay Standard #2（≈50 ng/µL）的1:2稀释液作为定量准确性的对照。

实验结果

研究问题

• RQ1 在NextSeq 500平台上，何种上样浓度能最大化单链文库的簇产量和数据质量？
• RQ2 单链文库的簇密度可提高到多高，而不会导致数据质量下降？
• RQ3 在NextSeq 500平台上高效测序单链文库的双重索引时，需要何种定制测序引物？
• RQ4 能否仅使用Qubit和Tapestation实现可靠的文库定量，而无需qPCR？
• RQ5 文库浓度和片段大小分布如何影响单链文库测序中簇密度的一致性？

主要发现

• 在2.2 pM浓度下上样单链文库，相比标准的1.8 pM，显著改善了簇形成，尤其对短片段古DNA更为明显。
• 簇密度高达250 k/mm²时，仍能保持超过80%的簇通过双重质控（chastity）和q30过滤，表明数据质量优异。
• 数据产量在簇密度达到约250 k/mm²之前呈近乎线性增长，超过200–250 k/mm²后仅出现轻微下降。
• 定制的索引读取2号引物（Gesaffelstein）可实现单链文库的高效双重索引测序，而使用标准引物则无法成功。
• 基于典型片段长度和Qubit定量结果估算摩尔浓度，可实现一致且可预测的簇密度，无需依赖qPCR。
• 初始浓度低于2.5 nM的文库会产生不一致的测序结果，表明这是可靠混合的实用下限。