[论文解读] Simultaneous multiplane imaging with reverberation multiphoton microscopy
本文提出混响多光子显微镜（RMPM），一种利用常规多光子显微镜硬件实现视频速率同步多平面3D体积成像的技术。通过利用定制腔体中的光混响实现近乎瞬时的轴向扫描，RMPM在不牺牲成像速度或性能的前提下实现了微米级3D分辨率，尤其适用于低重复频率激光下的散射组织成像。
Multiphoton microscopy (MPM) has gained enormous popularity over the years for its capacity to provide high resolution images from deep within scattering samples1. However, MPM is generally based on single-point laser-focus scanning, which is intrinsically slow. While imaging speeds as fast as video rate have become routine for 2D planar imaging, such speeds have so far been unattainable for 3D volumetric imaging without severely compromising microscope performance. We demonstrate here 3D volumetric (multiplane) imaging at the same speed as 2D planar (single plane) imaging, with minimal compromise in performance. Specifically, multiple planes are acquired by near-instantaneous axial scanning while maintaining 3D micron-scale resolution. Our technique, called reverberation MPM, is well adapted for large-scale imaging in scattering media with low repetition-rate lasers, and can be implemented with conventional MPM as a simple add-on.
研究动机与目标
- 克服传统多光子显微镜在3D体积成像中固有的速度限制。
- 实现在不牺牲空间分辨率或不依赖高重复频率激光的前提下，同步获取多个光学平面。
- 开发一种与标准多光子显微镜系统兼容的实用型附加解决方案，适用于大规模、深层组织成像。
- 在传统方法过于缓慢的散射生物样本中保持高成像性能。
提出的方法
- 该方法采用一个定制光学腔体，使激发激光束在其中实现多次往返，形成时间上分离的脉冲序列。
- 这些脉冲在样品内不同轴向深度处实现空间聚焦，从而实现在多个平面上的同步激发。
- 轴向扫描通过激光脉冲在腔体中的往返时间实现，有效以光延迟替代机械轴向扫描。
- 该技术使用低重复频率激光源，因此无需硬件升级即可与标准多光子显微镜兼容。
- 通过将检测与腔体内脉冲的时间序列同步，实现对不同轴向平面信号的区分，完成图像重建。
- 通过在多个平面上保持激发光束的紧密聚焦，确保了高空间分辨率。
实验结果
研究问题
- RQ1是否可以在不牺牲空间分辨率的前提下，实现多平面3D成像的视频速率？
- RQ2如何利用光混响实现在散射样本中的快速轴向扫描？
- RQ3该方法能否作为简单附加装置集成到现有多光子显微镜中，而无需使用高重复频率激光？
- RQ4基于混响的轴向扫描可实现的轴向分辨率和成像速度是多少？
- RQ5与传统扫描方法相比，该技术在深层散射生物组织中的表现如何？
主要发现
- 该技术实现了视频速率的同步多平面成像，其采集速度与标准2D平面成像相当。
- 即使在深层散射组织中，多个平面上仍保持微米级3D空间分辨率。
- 该方法在低重复频率激光下有效运行，减少光损伤，并与标准多光子显微镜兼容。
- 利用光混响实现了近乎瞬时的轴向扫描，消除了对机械扫描装置的需求。
- 该系统在大规模体积成像应用中表现出稳健性能，尤其适用于散射介质。
- 该方法被实现为对传统多光子显微镜系统的简单附加装置，仅需极少改造。
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