[论文解读] Spatial and temporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells in a 3D environment revealed by a machine learning-assisted FRET technique

Brian C. H. Cheung, Louis Hodgson+2 more|arXiv (Cornell University)|Sep 29, 2021

Cellular Mechanics and Interactions参考文献 78被引用 11

一句话总结

本研究提出一种机器学习辅助的FRET技术，用于绘制单个MDA-MB-231乳腺癌细胞在二维和三维环境中迁移时RhoA活性的时空动态。通过使用U-Net神经网络进行精确的细胞分割，作者发现RhoA活性在二维环境中表现出从前到后的极性分布，具有明显的振荡动力学；而在三维环境中则保持非极性分布，且与速度的相关性较低，但与细胞拉长在两个维度中均密切相关。

ABSTRACT

One of the hallmarks of cancer cells is their exceptional ability to migrate within the extracellular matrix (ECM) for gaining access to the circulatory system, a critical step of cancer metastasis. RhoA, a small GTPase, is known to be a key molecular switch that toggles between actomyosin contractility and lamellipodial protrusion during cell migration. Current understanding of RhoA activity in cell migration has been largely derived from studies of cells plated on a two-dimensional (2D) substrate using a FRET biosensor. There has been increasing evidence that cells behave differently in a more physiologically relevant three-dimensional (3D) environment, however, studies of RhoA activities in 3D have been hindered by low signal-to-noise ratio in fluorescence imaging. In this paper, we present a machine learning-assisted FRET technique to follow the spatiotemporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells (MDA-MB-231) migrating in a 3D as well as a 2D environment using a RhoA biosensor. We found that RhoA activity is more polarized along the long axis of the cell for single cells migrating on 2D fibronectin-coated glass versus those embedded in 3D collagen matrices. In particular, RhoA activities of cells in 2D exhibit a distinct front-to-back and back-to-front movement during migration in contrast to those in 3D. Finally, regardless of dimensionality, RhoA polarization is found to be correlated with cell shape.

研究动机与目标

• 为克服三维FRET成像中RhoA活性信噪比低的问题。
• 开发一种稳健、自动化的活细胞FRET与CFP图像对分割方法。
• 比较单个MDA-MB-231细胞在二维与三维细胞外基质中迁移时RhoA活性的时空动力学。
• 探究在两种环境中RhoA极性、细胞形态与迁移速度之间的关系。

提出的方法

• 采用一种基因编码的单链FRET探针（RhoA FLARE.sc），实现对活细胞中活性RhoA（GTP结合型）的比率检测。
• 应用U-Net卷积神经网络，对FRET和CFP荧光图像中的细胞轮廓进行精确、自动化的分割。
• 使用仿射变换和微珠校准的图像配准方法，实现FRET与CFP通道的亚像素精度对齐（配准后位移为0.045 µm）。
• 通过相对于细胞质心的强度加权位移矢量的矢量求和，计算RhoA极性。
• 应用Rao的间距检验，评估RhoA极性相对于细胞速度的方向性偏差。
• 使用Spearman等级相关性分析，量化极性强弱、细胞长宽比与迁移速度之间的关系。

实验结果

研究问题

• RQ1 RhoA活性在二维与三维迁移环境中的空间与时间分布有何差异？
• RQ2 在二维与三维环境中，RhoA极性与细胞长轴的对齐程度如何？
• RQ3 在二维与三维环境中，RhoA极性是否与细胞速度相关？
• RQ4 在二维与三维环境中，RhoA极性与细胞形态（长宽比）的关系如何？
• RQ5 RhoA活性在二维与三维环境中是否表现出周期性振荡？

主要发现

• 在二维环境中，RhoA活性表现出从前到后及从后到前的振荡动力学；而在三维环境中则保持非极性分布，且空间分布不均。
• 在二维环境中，RhoA极性与细胞长轴的对齐程度显著高于三维环境（余弦均值：0.82 vs. 0.65，p < 0.001）。
• 在二维与三维环境中，RhoA极性强弱均与细胞长宽比呈正向Spearman相关（ρ = 0.58，p < 0.0001；ρ = 0.42，p < 0.0001）。
• 细胞在二维环境中迁移速度显著快于三维环境（平均速度：1.8 µm/min vs. 0.9 µm/min），且在两种条件下，速度与极性之间均无显著相关性。
• 在二维环境中，部分细胞的RhoA极性表现出周期性振荡，主导周期约为30分钟；而在三维环境中未观察到此类周期性。
• Rao的间距检验证实，二维环境中RhoA极性与细胞速度呈强烈反向对齐（峰值出现在180°，p < 0.0001）；而在三维环境中，无特定角度偏好（p = 0.5000）。