[论文解读] Structured illumination microscopy for dual-modality 3D sub-diffraction resolution fluorescence and refractive-index reconstruction

Shwetadwip Chowdhury, Will J. Eldridge+2 more|arXiv (Cornell University)|Aug 15, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 71被引用 43

一句话总结

本文提出了一种结构光照明显微镜系统，通过将荧光超分辨成像与相干合成孔径显微镜结合，实现了三维双模态亚衍射分辨率成像，用于折射率（RI）重建。该方法可同时实现活细胞中分子荧光与生物物理RI分布的定量可视化，利用A549和HT-29细胞进行F-肌动蛋白染色，两种模态均实现了亚100 nm分辨率。

ABSTRACT

Though structured illumination (SI) microscopy is a popular imaging technique conventionally associated with fluorescent super-resolution, recent works have suggested its applicability towards sub-diffraction coherent imaging with quantitative endogenous biological contrast. Here, we demonstrate that SI can efficiently integrate the principles of fluorescent super-resolution and coherent synthetic aperture to achieve 3D dual-modality sub-diffraction resolution, fluorescence and refractive-index (RI) visualizations of biological samples. Such a demonstration can enable future biological studies to synergistically explore molecular and biophysical/biochemical mechanisms at sub-diffraction resolutions. We experimentally demonstrate this framework by introducing a SI microscope capable of 3D sub-diffraction fluorescence and RI imaging, and verify its biological visualization capabilities by experimentally reconstructing 3D RI/fluorescence visualizations of fluorescent calibration microspheres as well as alveolar basal epithelial adenocarcinoma (A549) and human colorectal adenocarcinmoa (HT-29) cells, fluorescently stained for F-actin.

研究动机与目标

• 开发一种单一光学平台，实现荧光与折射率（RI）模态下的三维亚衍射分辨率成像。
• 克服现有超分辨技术仅限于分子特异性荧光或内源性生物物理对比的局限性。
• 通过在亚衍射分辨率下共可视化分子结构（通过荧光）与生物物理特性（通过RI），实现协同的生物学洞察。
• 利用荧光微球和癌细胞系（A549、HT-29）进行F-肌动蛋白染色的生物样本验证该框架。

提出的方法

• 该系统采用结构光照明显微镜，在多个角度调制照明图案，实现合成孔径合成，以增强空间频率内容。
• 采用相干结构光照明显微镜，通过衍射断层扫描（DT）重建三维定量相位（QP）与折射率（RI），利用菲涅尔核进行数字传播。
• 荧光超分辨通过标准结构光照明显微镜原理实现，即利用多个图案化照明将高频信息移位并解码，突破光学衍射极限。
• 系统结合强度检测（荧光）与复振幅场检测（相干成像），实现从单一采集序列中联合重建两种模态。
• 对荧光与相干成像的三维传递函数（TF）进行建模，基于数值孔径（NA）、波长与探测角度定义横向与轴向分辨率边界。
• 重建算法采用迭代相位恢复与反滤波方法，从记录的强度图案中恢复高分辨率RI与荧光分布。

实验结果

研究问题

• RQ1 结构光照明显微镜能否同时实现荧光与折射率成像的亚衍射分辨率？
• RQ2 合成孔径显微镜与荧光超分辨的集成如何实现生物样本的双模态三维成像？
• RQ3 RI重建在多大程度上可将物理厚度与光程差（OPL）解耦，从而揭示仅靠定量相位成像无法呈现的生物相关结构细节？
• RQ4 在活癌细胞中，RI与荧光分布如何相关，特别是在细胞凋亡等过程中？
• RQ5 同一套光学系统与采集协议能否同时获得分子（荧光）与生物物理（RI）参数的定量、亚衍射分辨率数据？

主要发现

• 该系统在荧光与折射率成像中均实现了三维亚衍射分辨率，两种模态的横向分辨率均低于100 nm。
• 重建的RI图谱显示，在A549细胞中存在高RI局域化区域，其物理厚度显著小于细胞核与核仁，尽管光程差相似。
• 仅靠定量相位成像无法区分高OPL是由高RI还是大物理厚度引起；而RI重建可唯一解耦这两个参数。
• 在HT-29细胞中，膜泡的出现与高RI局域化区域的增加相关，经RI与荧光成像共同证实与细胞凋亡有关。
• 荧光成像显示膜泡附近F-肌动蛋白细胞骨架紊乱，而RI成像揭示致密的高RI结构，表明双模态提供了互补的结构信息。
• 即使在同一细胞系中，也观察到RI分布的细胞间差异，凸显了在定量成像研究中进行群体水平统计分析的必要性。