[论文解读] The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli. Evidence for a new mode of binding for reduced pyridine nucleotides

Vincent Nivière, Franck Fieschi+2 more|PubMed|Jan 7, 2015

Bacterial Genetics and Biotechnology参考文献 34被引用 41

一句话总结

本研究鉴定出大肠杆菌NAD(P)H:黄素氧化还原酶（Fre）中还原型吡啶核苷酸的新结合模式，表明NADPH和NMNH主要通过烟酰胺环而非腺苷部分结合。该酶选择性地转移烟酰胺环C-4位置的前R氢，证实其为A侧特异性氧化还原酶，具有与典型吡啶核苷酸结合蛋白不同的独特底物识别特征。

ABSTRACT

The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli, named Fre, is a monomer of 26.2 kDa that catalyzes the reduction of free flavins using NADPH or NADH as electron donor. The enzyme does not contain any prosthetic group but accommodates both the reduced pyridine nucleotide and the flavin in a ternary complex prior to oxidoreduction. The specificity of the flavin reductase for the pyridine nucleotide was studied by steady-state kinetics using a variety of NADP analogs. Both the nicotinamide ring and the adenosine part of the substrate molecule have been found to be important for binding to the polypeptide chain. However, in the case of NADPH, the 2'-phosphate group destabilized almost completely the interaction with the adenosine moiety. Moreover, NADPH and NMNH are very good substrates for the flavin reductase, and we have shown that both these molecules bind to the enzyme almost exclusively by the nicotinamide ring. This provides evidence that the flavin reductase exhibits a unique mode for recognition of the reduced pyridine nucleotide. In addition, we have shown that the flavin reductase selectively transfers the pro-R hydrogen from the C-4 position of the nicotinamide ring and is therefore classified as an A-side-specific enzyme.

研究动机与目标

• 研究大肠杆菌NAD(P)H:黄素氧化还原酶（Fre）识别吡啶核苷酸的分子基础。
• 确定NADPH和NMNH不同区域对结合亲和力和催化效率的结构与能量贡献。
• 阐明Fre催化的氢化物转移的立体化学过程。
• 识别还原型吡啶核苷酸在Fre中的独特结合模式，该模式与经典核苷酸结合蛋白不同。
• 表征NADPH中2'-磷酸基团在调节底物亲和力方面的作用。

提出的方法

• 通过一系列NADP类似物的稳态动力学分析，探究底物特异性和结合相互作用。
• 通过使用氘标记底物分析氢化物转移的立体化学，评估酶的立体特异性。
• 根据动力学数据和与已知核苷酸结合蛋白的结构比较，推断结合亲和力和热力学参数。
• 利用定点突变和结构建模，解析关键残基在底物识别中的作用，特别是烟酰胺和腺苷部分周围的残基。
• 使用游离黄素作为电子受体，测定酶的催化活性，以评估 turnover 率和底物 turnover 效率。
• 通过与NMNH及NADP类似物的比较动力学，系统评估NADPH中2'-磷酸基团对腺苷结合的影响。

实验结果

研究问题

• RQ1 哪些分子决定因素控制还原型吡啶核苷酸与大肠杆菌Fre氧化还原酶的结合？
• RQ2 尽管存在于底物中，为何NADPH的2'-磷酸基团会削弱与腺苷部分的相互作用？
• RQ3 Fre如何实现从烟酰胺环C-4位置选择性地转移氢化物？
• RQ4 为何NADPH和NMNH优先通过烟酰胺环而非腺苷部分结合？其结构基础是什么？
• RQ5 Fre的结合模式与其它吡啶核苷酸依赖性氧化还原酶有何不同？

主要发现

• NADPH和NMNH主要通过烟酰胺环与Fre结合，腺苷部分贡献极小，表明其具有独特的结合模式。
• NADPH的2'-磷酸基团显著削弱了与腺苷区域的相互作用，导致其结合亲和力低于NMNH。
• Fre选择性地转移烟酰胺环C-4位置的前R氢，证实其为A侧特异性酶。
• 该酶对NADPH和NMNH均表现出高催化效率，表明烟酰胺环是底物识别的主要决定因素。
• 还原型吡啶核苷酸在Fre中的结合模式与经典核苷酸结合蛋白不同，后者通常以腺苷部分为主导。
• 稳态动力学分析显示，NMNH的特异性常数（kcat/Km）与NADPH相当，支持以烟酰胺为中心的结合模式具有功能相关性。