[论文解读] Tracking of individual freely diffusing fluorescent protein molecules in the bacterial cytoplasm

Brian P. English, Arash Sanamrad+3 more|arXiv (Cornell University)|Mar 10, 2010

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 28被引用 5

一句话总结

本研究开发了一种超分辨率成像方法，结合频闪激光激发与随机光活化，用于在活体细菌细胞中追踪单个 mEos2 荧光蛋白分子。研究揭示了其正常扩散行为，扩散系数为 13.1 ± 1.2 μm²/s，为细菌细胞内分子动力学的单分子研究奠定了基础。

ABSTRACT

We combine stroboscopic laser excitation with stochastic photoactivation and super-resolution fluorescence imaging. This makes it possible to record hundreds of diffusion trajectories of small protein molecules in single bacterial cells with millisecond time resolution and sub-diffraction limited spatial precision. We conclude that the small protein mEos2 exhibits normal diffusion in the bacterial cytoplasm with a diffusion coefficient of 13.1 -+ 1.2 μm^2 s^(-1). This investigation lays the groundwork for studying single-molecule binding and dissociation events for a wide range of intracellular processes.

研究动机与目标

• 实现对活体细菌细胞中自由扩散的单个荧光蛋白进行高分辨率、实时追踪。
• 克服传统荧光显微技术在致密细胞环境中解析单分子动力学的局限性。
• 以毫秒时间分辨率和亚衍射空间分辨率，量化小蛋白在细菌细胞质中的扩散行为。
• 建立一个稳健的平台，用于研究细胞内过程中单分子结合与解离事件。
• 为利用单分子成像技术分析原核细胞中分子迁移性提供定量框架。

提出的方法

• 采用频闪激光激发，实现对荧光蛋白激活的时序控制。
• 结合随机光活化与超分辨率荧光成像，分离并追踪单个分子。
• 使用毫秒时间分辨率的延时成像，记录活体大肠杆菌细胞中 mEos2 的扩散轨迹。
• 应用亚衍射限空间精度，精确定位单个荧光分子。
• 实施图像处理，从背景噪声中提取并分析单个分子轨迹。
• 通过追踪轨迹的均方位移（MSD）分析计算扩散系数。

实验结果

研究问题

• RQ1 小荧光蛋白在拥挤的细菌细胞质中的扩散行为如何？
• RQ2 能否在活体细菌细胞中实现毫秒时间分辨率和亚衍射空间分辨率的单分子追踪？
• RQ3 mEos2 的扩散系数与在黏稠细胞环境中自由扩散的理论预测相比如何？
• RQ4 细菌细胞质在多大程度上限制或促进小蛋白的运动？
• RQ5 随机光活化与频闪激发能否实现活细胞中单个分子的可靠、长期追踪？

主要发现

• 单个 mEos2 分子在细菌细胞质中表现出正常的（布朗运动）扩散。
• 通过单分子追踪，高精度测得 mEos2 的扩散系数为 13.1 ± 1.2 μm²/s。
• 该方法实现了以毫秒时间分辨率记录数百条单个扩散轨迹。
• 实现了亚衍射空间精度，可精确定位单个荧光分子。
• 该技术适用于在单分子水平研究瞬时结合与解离事件。
• 结果验证了 mEos2 作为活体细菌中单分子动力学可靠荧光探针的适用性。