[论文解读] Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future

Rabilloud, Thierry, Chevallet, Mireille+2 more|arXiv (Cornell University)|Aug 16, 2010

Advanced Proteomics Techniques and Applications被引用 371

一句话总结

本综述追溯了二维凝胶电泳（2D-GE）从其在蛋白质组学兴起初期所起的基础性作用，到其在现代蛋白质组学研究中当前特定应用的演变历程。综述详细阐述了2D-GE如何通过等电聚焦与质谱鉴定相结合，实现完整蛋白质的高分辨率分离，并讨论了其在检测翻译后修饰方面的持久价值，尽管其动态范围有限且重复性不足，导致其作为主要工具的地位被更灵敏、高通量的方法所取代。

ABSTRACT

Two-dimensional gel electrophoresis has been instrumental in the birth and developments of proteomics, although it is no longer the exclusive separation tool used in the field of proteomics. In this review, a historical perspective is made, starting from the days where two-dimensional gels were used and the word proteomics did not even exist. The events that have led to the birth of proteomics are also recalled, ending with a description of the now well-known limitations of two-dimensional gels in proteomics. However, the often-underestimated advantages of two-dimensional gels are also underlined, leading to a description of how and when to use two-dimensional gels for the best in a proteomics approach. Taking support of these advantages (robustness, resolution, and ability to separate entire, intact proteins), possible future applications of this technique in proteomics are also mentioned.

研究动机与目标

• 系统记录二维凝胶电泳从早期实验阶段到其在蛋白质组学诞生过程中所起作用的时序发展。
• 分析历史上限制2D-GE重复性和灵敏度的技术挑战，特别是基于载体两性电解质的等电聚焦所面临的问题。
• 评估固定pH梯度（IPG）条带在提升重复性及实现跨实验室比较方面所起的变革性影响。
• 评估2D-GE与蛋白质微分析技术（如Edman测序和质谱）整合的影响，这些技术使蛋白质鉴定成为可能，并开启了蛋白质组学时代。
• 识别2D-GE在当前及未来蛋白质组学中的应用，特别是在检测翻译后修饰和完整蛋白质异构体方面的应用。

提出的方法

• 基于关键文献和2D-GE技术里程碑的历史分析，包括O'Farrell于1975年的论文以及IPG条带的引入。
• 回顾从载流两性电解质管状凝胶等电聚焦到现代IPG条带的技术演变，强调pH梯度稳定性与重复性的改进。
• 分析考马斯亮蓝染色、银染色和自显影技术在提升检测灵敏度和图像质量方面的作用。
• 评估2D-GE与蛋白质鉴定技术（包括Edman测序和质谱）的整合，使从凝胶点中鉴定蛋白质成为可能。
• 讨论2D-GE在检测翻译后修饰中的应用，如过氧化物还原酶的氧化（pI变化0.25单位）和血浆蛋白中的脱酰胺化。
• 提供案例研究和图表，说明窄pH梯度在分辨率提升方面的效果，以及在下游分析中实现的微克级制备能力。

实验结果

研究问题

• RQ1 二维凝胶电泳如何从一项小众技术演变为蛋白质组学的基石性工具？
• RQ2 早期2D-GE的主要技术限制是什么，特别是关于重复性和灵敏度方面？这些限制是如何被克服的？
• RQ3 2D-GE与蛋白质微分析技术整合后，以何种方式实现了蛋白质鉴定，并促成了蛋白质组学的诞生？
• RQ4 尽管高通量液相色谱-质谱（LC-MS）平台兴起，2D-GE为何至今仍具相关性？
• RQ5 2D-GE在检测翻译后修饰和完整蛋白质异构体方面的当前与未来应用是什么？

主要发现

• 20世纪80年代末引入的固定pH梯度（IPG）条带显著提升了重复性，实现了跨实验室比较，并减少了因载体两性电解质批次差异带来的变异性。
• 2D-GE利用自显影技术可检测单张凝胶上超过100个蛋白质点，这一里程碑式成就彰显了该技术的高分辨率潜力。
• 该技术可可视化细微的翻译后修饰，例如过氧化物还原酶2中半胱氨酸51氧化导致的0.25个pH单位的pI位移，可通过银染色检测。
• 微克级制备的2D-GE可从单张凝胶中分离出15 mg小鼠肝线粒体蛋白，支持后续质谱等分析。
• 窄pH梯度（如5–6）可分辨在宽梯度（4–8）中共同迁移的紧密迁移蛋白质，如肌动蛋白异构体，显示出分辨率的显著提升。
• 尽管在主流蛋白质组学中的使用已减少，2D-GE仍因其基于等电点和分子量分离蛋白质的能力，对检测完整蛋白质及特定PTM（如脱酰胺化和磷酸化）具有重要价值。