[论文解读] Validation of Golden Gate assemblies using highly multiplexed Nanopore amplicon sequencing

Adán Andrés Ramírez Rojas, Cedric K. Brinkmann+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 25, 2024

Genomics and Phylogenetic StudiesBiochemistry, Genetics and Molecular Biology被引用 3

一句话总结

本论文提出了一种基于Oxford Nanopore测序的高多重化、双条形码扩增子测序工作流程，用于验证复杂Golden Gate组装，特别是当使用元件文库而非已定义、经验证的元件时。该方法可实现全面、经济高效且高通量的验证，直接从单克隆菌落获得准确、可解释的测序报告，仅需极少人工操作时间，并对序列错误或嵌合体具有高灵敏度。

ABSTRACT

Golden Gate cloning has revolutionized synthetic biology. Its concept of modular, highly characterized libraries of parts that can be combined into higher order assemblies allows engineering principles to be applied to biological systems. The basic parts, typically stored in level 0 plasmids, are sequence validated by the method of choice and can be combined into higher order assemblies on demand. Higher order assemblies are typically transcriptional units, and multiple transcriptional units can be assembled into multi-gene constructs. Higher order Golden Gate assembly based on defined and validated parts usually does not introduce sequence changes. Therefore, simple validation of the assemblies, e.g. by colony PCR or restriction digest pattern analysis, is sufficient. However, in many experimental setups, researchers do not use defined parts, but rather part libraries, resulting in assemblies of high combinatorial complexity where sequencing again becomes mandatory. Here we present a detailed protocol for the use of a highly multiplexed dual barcode amplicon sequencing using the Nanopore sequencing platform for in-house sequence validation. The workflow, called DuBA.flow, is a start-to-finish procedure that provides all necessary steps from a single colony to the final easy-to-interpret sequencing report.

研究动机与目标

• 解决使用元件文库而非已定义、经测序验证的元件所生成的高复杂度Golden Gate组装的验证挑战。
• 开发一种端到端的简化工作流程，利用Nanopore测序实现自建实验室对Golden Gate组装的验证。
• 实现高通量、低成本且准确地检测组合式组装中的序列错误、嵌合体或非预期重排。
• 提供用户友好、易于解读的测序报告，直接从单克隆菌落获得，无需依赖Sanger测序或低复杂度方法。

提出的方法

• 采用高度多重化的扩增子测序结合双条形码，对单个克隆及其PCR扩增子进行唯一标记。
• 利用Oxford Nanopore测序技术生成长读长、高准确度的测序数据，适用于检测复杂组装错误。
• 应用自定义生物信息学分析流程，实现样本去多重化、将测序读段比对至预期构建物，并识别序列变异、嵌合体或突变。
• 整合从单克隆到报告的全流程，最大限度减少人工步骤，实现对组合式Golden Gate组装的快速验证。
• 采用双条形码策略以防止样本交叉污染，提升多重化容量和数据可靠性。
• 生成最终报告，清晰显示每个组装构建物的身份及其保真度，包括错误检测和变异识别。

实验结果

研究问题

• RQ1 是否可以利用Nanopore测序的高多重化、双条形码扩增子测序方法，可靠地验证来自元件文库的复杂Golden Gate组装？
• RQ2 与传统的Sanger测序或限制性酶切分析等验证技术相比，该方法在通量、准确度和错误检测方面表现如何？
• RQ3 该工作流程在多大程度上能够检测到组合式组装中的嵌合构建物、点突变或错误的元件融合？
• RQ4 该方法是否可在标准分子生物学实验室中实现，且仅需极少生物信息学专业知识，无需依赖外部测序服务？

主要发现

• 该方法可在单次测序运行中同时验证数百个Golden Gate组装，与Sanger测序相比显著提升了通量。
• 双条形码策略有效防止了样本交叉污染，并可在高多重化深度下实现准确的去多重化。
• 该工作流程成功检测到传统菌落PCR或限制性酶切分析无法识别的复杂组装中的序列错误、嵌合融合及错误的元件组合。
• 最终的测序报告具有高度可读性，可直接从单克隆菌落提供关于构建物身份和保真度的清晰、可操作的数据。
• 从挑菌到最终报告的整个工作流程可在单一实验室中完成，人工操作时间极少，且仅需常规实验设备。
• 该方法对低丰度错误和嵌合体具有高灵敏度，适用于高保真度合成生物学应用。