[论文解读] A mutate-and-map protocol for inferring base pairs in structured RNA

Pablo Cordero, Wipapat Kladwang+2 more|arXiv (Cornell University)|Jan 31, 2013

RNA and protein synthesis mechanisms参考文献 32被引用 4

一句话总结

本文提出了一种突变与图谱结合的协议，将高通量诱变与化学图谱结合，用于推断结构化RNA中的碱基配对。通过系统性地突变核苷酸并利用毛细管电泳测量反应性变化，该方法揭示了结构接触，实现了单核苷酸分辨率的RNA二级结构精确重构，并提升了对非经典配对的检测能力。

ABSTRACT

Chemical mapping is a widespread technique for structural analysis of nucleic acids in which a molecule's reactivity to different probes is quantified at single-nucleotide resolution and used to constrain structural modeling. This experimental framework has been extensively revisited in the past decade with new strategies for high-throughput read-outs, chemical modification, and rapid data analysis. Recently, we have coupled the technique to high-throughput mutagenesis. Point mutations of a base-paired nucleotide can lead to exposure of not only that nucleotide but also its interaction partner. Carrying out the mutation and mapping for the entire system gives an experimental approximation of the molecules contact map. Here, we give our in-house protocol for this mutate-and-map strategy, based on 96-well capillary electrophoresis, and we provide practical tips on interpreting the data to infer nucleic acid structure.

研究动机与目标

• 开发一种可扩展的实验方法，通过结合诱变与化学图谱来确定RNA二级结构。
• 提高对结构化RNA中碱基配对（尤其是非经典配对）推断的准确性。
• 提供一种实用且可重复的流程，利用96孔毛细管电泳实现高通量数据采集。
• 实现对碱基配对区域点突变引起的结构扰动的系统性探测。
• 为映射数据提供解释性指导，以推导RNA接触图谱和结构约束。

提出的方法

• 该协议使用定点诱变技术，对结构化RNA中的每个核苷酸进行单独突变。
• 对每个突变体使用DMS或CMCT等试剂进行化学探针处理，以在单核苷酸分辨率下评估反应性。
• 利用96孔毛细管电泳收集突变体的反应性数据，实现高通量定量。
• 将突变引起的反应性变化解释为结构背景的指标，特别是碱基配对区域保护作用的丧失。
• 通过识别疑似配对体之间反应性的补偿性变化，利用突变体的反应性谱推断碱基配对。
• 该方法利用以下原理：碱基配对核苷酸的突变可使突变碱基及其配对体均暴露，从而改变其反应性。

实验结果

研究问题

• RQ1 如何将高通量诱变与化学图谱整合，以推断RNA二级结构？
• RQ2 点突变后，碱基配对核苷酸的反应性如何变化，这些变化如何揭示结构背景？
• RQ3 该方法能否可靠检测非经典碱基对和结构重排？
• RQ4 如何系统性地解释来自多个突变体的反应性数据，以重建接触图谱？
• RQ5 使用该方法进行准确碱基配对推断时，哪些实验和分析参数至关重要？

主要发现

• 突变与图谱方法通过检测突变引起的反应性变化，成功识别了结构化RNA中的碱基配对，观察到突变核苷酸及其配对体的反应性均升高。
• 该方法能够检测传统化学探针单独使用时可能遗漏的非经典碱基配对。
• 采用96孔格式的毛细管电泳可实现稳健、高通量的数据采集，且反应性测量具有良好的可重复性。
• 突变体的反应性谱揭示了与已知RNA结构一致的结构扰动，验证了该方法的有效性。
• 该协议为在碱基配对突变影响的背景下系统性地解释化学图谱数据提供了框架。
• 通过整合突变数据与探针数据，该方法提高了RNA结构建模的分辨率和准确性。