[论文解读] Structured illumination fluorescence microscopy using Talbot self-imaging effect for high-throughput visualization

Shwetadwip Chowdhury, Jeffrey Chen+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 10, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 12被引用 6

一句话总结

本文提出了一种新颖的结构光照明显微镜（SIM）方法，利用塔尔博特自成像效应生成大视场、亚衍射分辨率的光栅图案，且不受物镜数值孔径（NA）的限制。通过将定制的周期性结构元件置于塔尔博特距离一半的整数倍位置，该方法在450 × 350 µm视场范围内实现了500 nm分辨率——相比显微镜物镜的2 µm衍射极限提升了四倍——从而实现了高通量超分辨率荧光成像。

ABSTRACT

We report a novel extension to structured illumination (SI) microscopy that utilizes the Talbot self-imaging effect to generate a SI pattern on a sample with field-of-view (FOV) and resolution unconstrained by the numerical aperture (NA) of the microscope objective. This enables high-resolution SI pattern generation (up to the free-space propagation limit) across large FOVs, which in turn allows SI microscopy to be efficiently adapted for high-throughput imaging. We demonstrated this concept using a simple prototype microscope to image a large FOV (450 x 350 um) with a diffraction-limited fluorescence resolution limited by the microscope NA to 2 um. A custom-fabricated structured element, designed with periodic spatial features beyond the diffraction limit of the microscope imaging objective, was positioned to within an integer multiple of half the Talbot distance away from the sample. This generated a large FOV, sub-diffraction SI pattern at the sample plane via the Talbot self-imaging effect. Conventional SI super-resolution principles were then used to increase imaging resolution to 500 nm across the complete FOV, roughly a factor of 4 improvement over the microscope NA diffraction limit. This approach should also be applicable for high-throughput sub-diffraction resolution multimodal imaging.

研究动机与目标

• 为克服传统显微镜物镜数值孔径（NA）对结构光照明显微镜（SIM）视场和分辨率的限制。
• 通过生成大面积、亚衍射分辨率的结构化照明图案，实现高通量超分辨率荧光成像。
• 利用塔尔博特自成像效应，将照明图案的空间频率内容扩展至成像物镜的衍射极限之外。
• 通过基于原型的实验实现，展示该方法在大视场范围内具有定量分辨率提升的可行性。

提出的方法

• 使用具有周期性空间结构、尺寸小于显微镜物镜衍射极限的定制加工结构元件，生成周期性照明图案。
• 将结构元件置于距样品为塔尔博特距离一半的整数倍的位置，以激发塔尔博特自成像效应。
• 塔尔博特效应在样品平面产生自复制的、高空间频率的干涉图案，实现在大视场范围内的结构化照明。
• 自成像效应在整片视场范围内生成亚衍射分辨率的图案，且与物镜的NA无关。
• 对获取的图像应用传统SIM重建算法，实现超越衍射极限的超分辨率。
• 通过配备2 µm衍射极限物镜的简易原型显微镜对方法进行实验验证。

实验结果

研究问题

• RQ1 塔尔博特自成像效应是否可用于荧光显微镜中生成大视场、亚衍射分辨率的结构化照明图案？
• RQ2 该方法是否能够克服显微镜物镜数值孔径所导致的视场和分辨率限制？
• RQ3 该方法是否能在不依赖高NA物镜的前提下，在大视场范围（例如450 × 350 µm）内实现一致的超分辨率成像（如500 nm）？
• RQ4 基于塔尔博特的结构化照明方法是否适用于荧光显微镜中的高通量成像应用？
• RQ5 该方法是否可扩展至多模态、高通量的亚衍射分辨率成像？

主要发现

• 塔尔博特自成像效应成功在450 × 350 µm视场范围内生成了大视场、亚衍射分辨率的结构化照明图案。
• 该方法在整片视场范围内实现了500 nm的分辨率，相比显微镜物镜2 µm的衍射极限提升了四倍。
• 分辨率提升未依赖物镜数值孔径的增加，而是基于周期性结构元件的自成像效应实现。
• 结构元件的特征尺寸超越了成像物镜的衍射极限，从而实现了高空间频率图案的生成。
• 在塔尔博特距离一半的整数倍位置观察到自成像效应，证实了该方法的理论基础。
• 该方法通过解耦分辨率与物镜NA，展示了实现高通量超分辨率荧光成像的可行性。