[논문 리뷰] 4D Liquid-phase Electron Microscopy of Ferritin by Brownian Single Particle Analysis

Gabriele Marchello, Cesare De Pace외 3명|arXiv (Cornell University)|2019. 07. 07.

Advanced Electron Microscopy Techniques and Applications참고 문헌 30인용 수 5

한 줄 요약

이 논문은 4차원 액상 전자현미경을 위한 브라운 운동 단일 입자 분석(BSPA)을 소개하며, 단일 입자 평균을 통해 브라운 운동을 이용해 용액 내 페리틴 동역학을 실시간으로 추적할 수 있도록 한다. 냉동 전자현미경(cryo-EM)에서의 촬영 시간이 수시간에서 단 몇 초로 단축됨에 따라, BSPA는 구조적 변화, 수화 동역학, 열적 변동을 포착할 수 있으며, 이는 동적 구조 생물학의 기초를 마련한다.

ABSTRACT

Protein function and activity are a consequence of its three-dimensional structure. Single particle analysis of cryogenic electron micrographs has radically changed structural biology allowing atomic reconstruction of almost any type of proteins. While such an approach provides snapshots of three-dimensional structural information that can be correlated with function, the new frontier of protein structural biology is in the fourth dimension, time. Here we propose the use of liquid phase electron microscopy to expand structural biology into dynamic studies. We apply here single particle analysis algorithm to images of proteins in Brownian motion through time; thus, Brownian single particle analysis (BSPA). BSPA enables to reduce the acquisition time from hours, in cryo-EM, to seconds and achieve information on conformational changes, hydration dynamics, and effects of thermal fluctuations. Yielding all these previously neglected aspects, BSPA may lead to the verge of a new field: dynamic structural biology.

연구 동기 및 목표

• 단백질의 동적 과정을 촬영함으로써 구조 생물학을 네 번째 차원인 시간으로 확장한다.
• 촬영 시간이 수시간이 소요되는 냉동 전자현미경(cryo-EM)의 한계를 극복한다.
• 얼음으로 굳히지 않고도 용액 내 단백질의 고속, 시간 해상도 영상 촬영이 가능한 방법을 개발한다.
• 브라운 운동, 열적 변동 및 수화가 단백질의 구조와 동역학에 미치는 영향을 연구한다.
• 액상 전자현미경을 활용한 동적 구조 생물학의 새로운 프레임워크를 구축한다.

제안 방법

• 실시간으로 수용액 내 페리틴 입자를 액상 전자현미경(LP-EM)로 촬영한다.
• 브라운 운동을 겪는 단백질의 영상에 단일 입자 분석(SPA)을 적용하여, 각 프레임을 다른 자세 또는 구조적 형태의 순간 영상로 간주한다.
• 시간에 따라 개별 입자 영상의 계산적 정렬 및 평균화를 통해 신호 대 잡음 비율을 향상시킨다.
• 용액 내 입자의 자연스러운 확산과 회전을 활용해 빠르게 다양한 구조적 형태를 샘플링한다.
• 시간 해상도 데이터를 통합하여 4차원의 구조 정보(3차원 구조 + 시간에 따른 변화)를 재구성한다.
• 통계적 분석을 통해 일시적인 입자 영상에서 구조적 변화, 수화 껍질의 동역학 및 열적 변동에 대한 정보를 추출한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 브라운 운동을 겪는 단백질에 대해 액상 전자현미경에서 단일 입자 분석을 어떻게 응용하여 동적 구조 정보를 추출할 수 있는가?
• RQ2 이 방법은 냉동 전자현미경(cryo-EM)에 비해 시간 해상도와 구조적 정확도에서 어느 정도의 성능을 달성할 수 있는가?
• RQ3 열적 변동과 수화 동역학은 페리틴 입자에서 관찰되는 구조적 이질성에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ4 이 방법을 사용해 페리틴의 구조적 변화를 실시간으로 해상할 수 있는가?
• RQ5 이러한 동적 구조 연구에서 브라운 운동을 구조적 형태 샘플링의 원천으로 사용할 때의 한계와 장점는 무엇인가?

주요 결과

• BSPA는 촬영 시간을 냉동 전자현미경(cryo-EM)에서 수시간에서 몇 초로 단축시켜 단백질의 동적 변화를 실시간으로 관찰할 수 있게 한다.
• 이 방법은 열적 변동과 브라운 운동로 인한 페리틴 입자의 구조적 변화를 성공적으로 포착한다.
• 입자 영상의 시간에 따른 구조적 변동을 통해 페리틴 주변의 수화 동역학을 관찰할 수 있다.
• 빠른 운동과 낮은 전자선량에도 불구하고, 충분한 신호 대 잡음 비율을 확보하여 구조 분석이 가능하다.
• 4차원 재구성은 정적인 냉동 전자현미경 연구에서 일반적으로 간과되는 일시적인 구조적 상태를 드러낸다.
• BSPA는 자연스러운 브라운 운동을 동적 구조 생물학의 구조적 형태 샘플링 원천으로 사용할 수 있음을 입증한다.