[논문 리뷰] A mutate-and-map protocol for inferring base pairs in structured RNA

Pablo Cordero, Wipapat Kladwang외 2명|arXiv (Cornell University)|2013. 01. 31.

RNA and protein synthesis mechanisms참고 문헌 32인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 고 throughput 돌연변이 유도와 화학적 맵핑을 조합하여 구조화된 RNA의 염기서열을 추론하는 mutate-and-map 프로토콜을 소개한다. 체계적으로 뉴클레오티드를 돌연변이화하고, 모세관 전기영동을 통해 반응성 변화를 측정함으로써, 구조적 접촉을 폭 드러내어 단일 뉴클레오티드 해상도로 정확한 RNA 이차 구조 재구성과 비표준 염기서열의 향상된 탐지가 가능하다.

ABSTRACT

Chemical mapping is a widespread technique for structural analysis of nucleic acids in which a molecule's reactivity to different probes is quantified at single-nucleotide resolution and used to constrain structural modeling. This experimental framework has been extensively revisited in the past decade with new strategies for high-throughput read-outs, chemical modification, and rapid data analysis. Recently, we have coupled the technique to high-throughput mutagenesis. Point mutations of a base-paired nucleotide can lead to exposure of not only that nucleotide but also its interaction partner. Carrying out the mutation and mapping for the entire system gives an experimental approximation of the molecules contact map. Here, we give our in-house protocol for this mutate-and-map strategy, based on 96-well capillary electrophoresis, and we provide practical tips on interpreting the data to infer nucleic acid structure.

연구 동기 및 목표

• 돌연변이 유도와 화학적 맵핑을 융합하여 RNA 이차 구조를 결정하는 확장 가능한 실험적 방법을 개발한다.
• 특히 비표준 염기서열에 대해 염기서열 추론의 정확도를 향상시킨다.
• 96-well 모세관 전기영동을 사용한 실용적이고 재현 가능한 워크플로우를 제공하여 고 throughput 데이터 수집을 가능하게 한다.
• 기본서열 영역에서의 점 돌연변이에 의해 유도되는 구조적 교란을 체계적으로 탐색할 수 있도록 한다.
• RNA 접촉 맵과 구조적 제약을 유추하기 위해 맵핑 데이터를 해석하는 지침을 제공한다.

제안 방법

• 프로토콜은 구조화된 RNA의 각 뉴클레오티드를 개별적으로 돌연변이 유도하기 위해 유도된 돌연변이 유도를 사용한다.
• 각 돌연변이체는 DMS 또는 CMCT와 같은 시약을 사용해 화학적 프로빙을 받아 단일 뉴클레오티드 해상도에서 반응성을 평가한다.
• 반응성 데이터는 96-well 모세관 전기영동을 사용해 고 throughput으로 정량화하여 수집된다.
• 돌연변이 유도에 따른 반응성 변화는 특히 기저서열 영역에서 보호 기능 상실을 나타내는 구조적 맥락의 지표로 해석된다.
• 돌연변이체의 반응성 프로파일은 상호 작용하는 것으로 추정되는 쌍의 반응성 변화를 식별함으로써 기저서열을 추론하는 데 사용된다.
• 이 방법은 기저서열을 형성하는 뉴클레오티드의 돌연변이 유도가 돌연변이 뉴클레오티드와 그 파트너의 둘 다를 노출시켜 반응성 변화를 유도한다는 원리를 활용한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 고 throughput 돌연변이 유도를 어떻게 화학적 맵핑과 융합하여 RNA 이차 구조를 추론할 수 있는가?
• RQ2 점 돌연변이 유도에 의해 기저서열 뉴클레오티드에서 발생하는 반응성 변화는 무엇이며, 이는 어떻게 구조적 맥락을 드러내는가?
• RQ3 이 방법은 비표준 기저서열과 구조적 재편성을 신뢰성 있게 탐지할 수 있는가?
• RQ4 다수의 돌연변이체에서 수집된 반응성 데이터를 어떻게 체계적으로 해석하여 접촉 맵을 재구성할 수 있는가?
• RQ5 이 방법을 사용해 정확한 기저서열 추론을 위해 필수적인 실험적 및 분석적 매개변수는 무엇인가?

주요 결과

• Mutate-and-map 접근법은 돌연변이 유도에 따른 반응성 변화를 감지함으로써 구조화된 RNA에서 기저서열을 성공적으로 식별한다. 돌연변이 유도된 뉴클레오티드와 그 파트너 모두에서 반응성이 증가하는 것이 관찰된다.
• 이 방법은 기존의 화학적 프로빙만으로는 놓칠 수 있는 비표준 기저서열을 탐지할 수 있다.
• 96-well 형식의 모세관 전기영동은 재현 가능한 반응성 측정과 함께 강력하고 고 throughput의 데이터 수집을 가능하게 한다.
• 돌연변이체의 반응성 프로파일은 알려진 RNA 구조와 일치하는 구조적 교란을 드러내어 이 방법의 타당성을 검증한다.
• 이 프로토콜은 기저서열 형성에 대한 돌연변이 효과를 고려한 화학적 맵핑 데이터의 체계적인 해석 프레임워크를 제공한다.
• 이 방법은 돌연변이 유도 데이터와 프로빙 데이터를 통합함으로써 RNA 구조 모델링의 해상도와 정확도를 향상시킨다.