[논문 리뷰] Alignment and Characterisation of Remote-Refocusing Systems

Wenzhi Hong, Hugh Sparks외 1명|PubMed|2023. 03. 31.

Advanced Electron Microscopy Techniques and Applications참고 문헌 21인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 광학 현미경에서 원거리 초점 조절 시스템의 정렬 및 성능 특성에 대해 연구하며, 주로 초점 렌즈와 튜브 렌즈의 축방향 및 횡방향 이탈이 영상 품질에 미치는 영향을 다룬다. 점 확산 함수(FWHM), 형광 신호 및 초점 조절 범위 전반의 왜곡을 측정함으로써, 광학 해상도에 도달하는 성능을 넓은 축방향 범위에서 확보할 수 있는 최적의 구성 조건을 규명하였으며, 주요 및 보조 목표 렌즈 간의 배율 비율이 시스템 성능의 핵심 결정 요소임을 확인하였다.

ABSTRACT

The technique of remote refocusing is used in optical microscopy to provide rapid axial scanning without mechanically perturbing the sample and in techniques such as oblique plane microscopy that build on remote refocusing to image a tilted plane within the sample. The magnification between the pupils of the primary (O1) and secondary (O2) microscope objectives of the remote-refocusing system has been shown previously by Mohanan and Corbett [J. Microsc.288, 95 (2022)JMICAR0022-272010.1111/jmi.12991] to be crucial in obtaining the broadest possible remote-refocusing range. In this work, we performed an initial alignment of a remote-refocusing system and then studied the effect of axial misalignments of O1 and O2, axial misalignment of the primary tube lens (TL1) relative to the secondary tube lens (TL2), lateral misalignments of TL2, and changes in the focal length of TL2. For each instance of the setup, we measured the mean point spread function <i>F</i> <i>W</i> <i>H</i> <i>M</i> _xy of 100 nm fluorescent beads and the normalized bead integrated fluorescence signal, and we calculated the axial and lateral distortion of the system; all of these quantities were mapped over the remote-refocusing range and as a function of lateral image position. This allowed us to estimate the volume over which diffraction-limited performance is achieved and how this changes with the alignment of the system.

연구 동기 및 목표

• 원거리 초점 조절 시스템에서 주요 및 보조 목표 렌즈의 축방향 및 횡방향 이탈이 광학 성능에 미치는 영향을 조사하기 위해.
• 튜브 렌즈의 초점 거리 변화와 목표 렌즈 정렬 변화가 원거리 초점 조절 범위에 미치는 영향를 규명하기 위해.
• 다양한 정렬 조건 하에서 광학 해상도 성능이 유지되는 부피를 정량화하기 위해.
• 형광 비드 영상 기반으로 원거리 초점 조절 시스템을 체계적으로 특성화하고 최적화하는 방법을 수립하기 위해.
• 주요 및 보조 목표 렌즈 간의 배율 비율이 최대 초점 조절 범위를 극대화하는 데 핵심적인 역할을 한다는 것을 검증하기 위해.

제안 방법

• 표준 광학 정렬 기법을 사용하여 원거리 초점 조절 시스템의 初기 정렬을 수행하였다.
• 주요(O1) 및 보조(O2) 목표 렌즈의 축방향 이탈을 체계적으로 도입하였다.
• 주요 튜브 렌즈(TL1)와 보조 튜브 렌즈(TL2) 간의 축방향 이탈을 변화시켰다.
• 보조 튜브 렌즈(TL2)의 횡방향 이탈을 유도하고 초점 거리를 조작하였다.
• 초점 조절 범위 전반 및 다양한 횡방향 위치에서 100 nm 형광 비드의 평균 FWHMxy를 측정하였다.
• 정규화된 비드 형광 신호를 정량화하고, 위치 및 초점 조절 거리에 따른 축방향 및 횡방향 왜곡을 계산하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 주요 및 보조 목표 렌즈의 축방향 이탈이 원거리 초점 조절 범위와 영상 품질에 미치는 영향는 어떠한가?
• RQ2 주요(TL1) 및 보조(TL2) 튜브 렌즈 간의 축방향 이탈이 시스템 성능에 미치는 영향는 무엇인가?
• RQ3 보조 튜브 렌즈(TL2)의 횡방향 이탈 및 초점 거리 변화가 축방향 및 횡방향 왜곡에 미치는 영향는 어떠한가?
• RQ4 다양한 정렬 조건 하에서 광학 해상도 성능이 유지되는 부피의 범위는 어느 정도인가?
• RQ5 주요 및 보조 목표 렌즈 간의 배율 비율이 실현 가능한 초점 조절 범위에 미치는 영향는 어떠한가?

주요 결과

• 주요 목표 렌즈(O1)의 축방향 이탈은 원거리 초점 조절 범위를 크게 감소시키고 FWHMxy를 증가시켜 영상 품질을 악화시킨다.
• 주요(TL1) 및 보조(TL2) 튜브 렌즈 간의 축방향 이탈은 측정 가능한 축방향 왜곡을 유발하며, 효과적인 초점 조절 범위를 감소시킨다.
• 보조 튜브 렌즈(TL2)의 횡방향 이탈은 시야의 가장자리에서 특히 두드러진 횡방향 왜곡을 유도하여 영상 정밀도에 영향을 준다.
• 보조 튜브 렌즈(TL2)의 초점 거리 변화는 배율 비율을 변화시켜 시스템이 넓은 원거리 초점 조절을 달성하는 능력에 직접적인 영향을 미친다.
• 이 연구는 광학 해상도 성능이 유지되는 부피를 극대화하는 특정 정렬 구성 조건을 규명하였으며, 넓은 축방향 범위에서 FWHMxy가 250 nm 이하로 유지됨을 확인하였다.
• O1과 O2 간의 배율 비율이 최대 실현 가능한 원거리 초점 조절 범위를 결정하는 데 핵심적인 요소임을 확인하였으며, 이는 이전 이론적 연구와 일치한다.