[논문 리뷰] Antioxidant activity and toxicity study of cerium oxide nanoparticles stabilized with innovative functional copolymers

Geoffroy Goujon, Victor Baldim외 10명|arXiv (Cornell University)|2021. 04. 07.

Advanced Nanomaterials in Catalysis참고 문헌 84인용 수 48

한 줄 요약

이 연구는 인산기반의 강력한 표면 결합을 갖는 기능성 공중합체로 코팅된 희토류 산화구리 나노입자(CNPs)를 개발하였으며, 생체 적합성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 아민기 끝을 가진 PEG를 포함하고 있다. 이 CNPs는 향상된 안정성과 유지된 촉매 작용성 산화방지 활성을 보이며, 뇌내피세포(bEnd.3)에서 세포독성 없이 작용한다. CNPs는 글루타메이트 유도 산화 스트레스에 의한 활성산소종(ROS)과 미토콘드리아 슈퍼옥사이드를 효과적으로 감소시키며, 마우스에서의 체내 독성도 관찰되지 않아, 뇌경색 관련 혈관 손상 치료에 유망한 후보로 위치한다.

ABSTRACT

Oxidative stress, which is one of the main harmful mechanisms of pathologies including is-chemic stroke, contributes to both neurons and endothelial cell damages, leading to vascular lesions. Although many antioxidants have been tested in preclinical studies, no treatment is currently available for stroke patients. Since cerium oxide nanoparticles (CNPs) exhibit remarkable antioxidant capacities, our objective is to develop an innovative coating to enhance CNPs biocompatibility without disrupting their antioxidant capacities or enhance their toxicity. This study reports the synthesis and characterization of functional polymers and their impact on the enzyme-like catalytic activity of CNPs. To study the toxicity and the antioxidant properties of CNPs for stroke and particularly endothelial damages, in vitro studies are conducted on a cerebral endothelial cell line (bEnd.3). Despite their internalization in bEnd.3 cells, coated CNPs are devoid of cytotoxicity. Microscopy studies report an intracellular localization of CNPs, more precisely in endosomes. All CNPs reduces glutamate-induced intracellular production of ROS in endothelial cells but one CNP significantly reduces both the production of mitochondrial super-oxide anion and DNA oxidation. In vivo studies report a lack of toxicity in mice. This study there-fore describes and identifies biocompatible CNPs with interesting antioxidant properties for ischemic stroke and related pathologies.

연구 동기 및 목표

• 뇌경색 치료를 위한 생체 적합성 있고 안정적인 산화구리 나노입자(CNPs)를 개발하고, 산화방지 활성을 유지한다.
• 인산기-PEG 공중합체를 이용해 새로운 고분자 코팅을 설계하여 CNPs의 안정성을 향상시키고 단핵구계 식세포계에 의한 청소를 감소시킨다.
• bEnd.3 뇌내피세포에서의 세포독성, 세포내 침입 및 세포내 국소화를 평가한다.
• 정맥 주입 후 마우스에서의 체내 독성 및 부위분포를 평가한다.
• 기능화된 CNPs가 내피세포에서 산화 스트레스, 특히 미토콘드리아 슈퍼옥사이드와 DNA 산화를 어떻게 완화할 수 있는지 규명한다.

제안 방법

• 산성 pH 조건에서 질산세륨의 열수분해를 통해 CNPs를 합성하고, 전자현미경(TEM), 동적광산란(DLS), X선광전자분광법(XPS), 회절분석(WAXS), 자외선-가시광선 분광법(UV-Vis)을 이용해 특성 분석을 수행하였다.
• 폴리메틸메타크릴레이트(PEMA) 기반의 통계적 공중합체를 설계 및 합성하였으며, 금속 결합을 위한 인산기와 스테일링 및 기능화를 위한 PEG 또는 아민기 끝을 가진 PEG를 공중합체에 공유결합하였다.
• 기능성 공중합체로 CNPs를 코팅하여 콜로이드 안정성과 생체 적합성을 향상시켰다.
• DPPH 시험과 하이드록실 라디칼 제거 시험을 통해 체외에서의 촉매 작용성 산화방지 활성을 평가하였다.
• bEnd.3 세포에서의 세포독성(세포생존율 측정), ROS 생성(DCFH-DA 형광), 세포내 국소화(시냅스 공형광현미경을 이용한 Cy5 라벨링된 CNPs 분석)를 평가하기 위해 체내 실험을 수행하였다.
• 스위스 마우스에서 정맥 주입을 통해 부위분포 및 독성 연구를 수행하였으며, 기관에서의 형광 강도 분석과 간, 신장, 비장, 폐, 뇌의 조직학적 평가를 실시하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 기능성 공중합체 코팅은 산화구리 나노입자의 콜로이드 안정성과 생체 적합성을 향상시키지만, 산화방지 활성을 손상시키지 않는가?
• RQ2 고분자 코팅된 CNPs는 글루타메이트에 의한 산화 스트레스 조건에서 뇌내피세포의 산화 스트레스, 특히 미토콘드리아 슈퍼옥사이드와 DNA 산화를 감소시키는가?
• RQ3 코팅된 CNPs의 세포내 운명과 국소화는 무엇이며, 그 침입 과정과 세포독성이 연관되어 있는가?
• RQ4 코팅된 CNPs는 체내에서 장기적인 안정성과 유리한 약리동역학적 특성을 보이는가?
• RQ5 정맥 주입 후 마우스에서 전신 독성 또는 기관 축적 증거가 있는가?

주요 결과

• 코팅된 CNPs는 수소수성 직경 9.8 nm와 14%의 Ce3+ 분율을 나타내어 촉매 활성에 필수적인 혼합 산화 상태를 보였다.
• DPPH 시험을 통해 강력한 산화방지 능력이 확인되었으며, IC50 값은 효과적인 라디칼 제거 능력을 시사하였다.
• 모든 코팅된 CNPs는 bEnd.3 세포에서 글루타메이트 유도 산화 스트레스에 의한 세포내 ROS를 감소시켰으며, 한 개의 제형(CeO2@P3)은 미토콘드리아 슈퍼옥사이드와 DNA 산화를 뚜렷이 감소시켰다.
• 공형광현미경 분석 결과 CNPs는 주로 엔도좀으로 침입한 것으로 확인되었으며, bEnd.3 세포에서 유의미한 세포독성이 관찰되지 않았다.
• 체내 연구에서 24시간 및 1개월 후 간, 신장, 비장, 폐, 뇌에서의 조직학적 변화나 혈액 수치의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다.
• 부위분포 분석 결과, 시간이 지남에 따라 기관에서 지속적인 형광이 관찰되었으며, 주요 장기에는 다량의 축적이 없어 저독성임을 뒷받침하며, 치료적 응용 가능성도 시사하였다.