[논문 리뷰] Bistability of an In Vitro Synthetic Autoregulatory Switch

Pakpoom Subsoontorn, Jongmin Kim외 1명|arXiv (Cornell University)|2011. 01. 04.

Gene Regulatory Network Analysis참고 문헌 83인용 수 36

한 줄 요약

이 연구는 T7 RNA 중합효소, RNase H, RNase R 세 가지 효소를 사용하여 네 개의 DNA 사슬으로 구성된 합성 in vitro DNA 스위치에서 정성적 자가조절을 통해 이중안정성을 입증한다. 스위치는 RNA 출력을 통해 자가활성화되며, 열역학적으로 제어되는 RNA-DNA 하이브리드화를 통해 안정된 케이스/오프 상태를 달성한다. RNase H는 이중안정성을 가능하게 하고, RNase R은 불완전한 전사 산물을 분해하여 신호의 정확성을 확보한다.

ABSTRACT

The construction of synthetic biochemical circuits is an essential step for developing quantitative understanding of information processing in natural organisms. Here, we report construction and analysis of an in vitro circuit with positive autoregulation that consists of just four synthetic DNA strands and three enzymes, bacteriophage T7 RNA polymerase, Escherichia coli ribonuclease (RNase) H, and RNase R. The modularity of the DNA switch template allowed a rational design of a synthetic DNA switch regulated by its RNA output acting as a transcription activator. We verified that the thermodynamic and kinetic constraints dictated by the sequence design criteria were enough to experimentally achieve the intended dynamics: a transcription activator configured to regulate its own production. Although only RNase H is necessary to achieve bistability of switch states, RNase R is necessary to maintain stable RNA signal levels and to control incomplete degradation products. A simple mathematical model was used to fit ensemble parameters for the training set of experimental results and was then directly applied to predict time-courses of switch dynamics and sensitivity to parameter variations with reasonable agreement. The positive autoregulation switches can be used to provide constant input signals and store outputs of biochemical networks and are potentially useful for chemical control applications.

연구 동기 및 목표

• 단지 DNA와 소수의 효소를 사용하여 최소한의 in vitro 합성 자가조절 스위치를 설계하고 구축하는 것.
• 단백질 기반 조절자가 없는 합성 생화학 회로에서 RNA-DNA 하이브리드화를 이용한 이중안정성의 입증.
• 스위치 행동과 신호 안정성을 규명하는 데 필요한 동역학적 및 열역학적 제약 조건의 규명.
• 베이지안 추론을 통해 적합화된 단순 수학적 모델을 이용하여 실험적 동역학을 검증하는 것.
• 이러한 스위치가 합성 생화학 네트워크에서 신호를 저장하고 화학적 제어를 가능하게 하는 잠재력 탐색.

제안 방법

• 스위치는 프로모터에 둘러싸인 템플릿(T-nt), 전사된 출력(rA), 활성화제(A), 억제제(dI)로 구성된 네 개의 합성 DNA 사슬로 구성되며, rA는 RNA-DNA 하이브리드화를 통해 스스로 전사 활성화제로 작용한다.
• 전사는 T7 RNA 중합효소에 의해 촉진되며, RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA를 절단하여 피드백 루프 작동을 가능하게 하고, RNase R은 잔류 RNA 조각을 분해하여 신호 잡음을 방지한다.
• 시스템은 세포 기계와의 의도치 않은 상호작용을 최소화하기 위해 순수한 in vitro 환경에서 운영되며, NTP를 연료로 사용한다.
• 스위치 동역학은 변성 다이아아크릴아미드 젤 전기영동과 형광 스펙트로스코피를 사용하여 시간에 따른 RNA 출력 수준을 측정함으로써 정량화된다.
• 11개의 속도 상수(k_T_A, k_M_ON, k_cat_OFF 등)를 포함하는 동역학 모델이 수립되었으며, 메트로폴리스 알고리즘을 사용한 베이지안 추론를 통해 실험 데이터에 적합화된다.
• 후행 분포에서 샘플링된 매개변수 세트를 이용해 스위치 행동 예측 및 농도 변화에 대한 민감도 분석을 수행한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 최소한의 in vitro 합성 회로에서 정성적 자가조절을 통해 DNA와 소수의 효소만을 사용하여 이중안정성 전환을 달성할 수 있는가?
• RQ2 RNase H와 RNase R은 스위치의 케이스 및 오프 상태를 어떻게 유도하고 안정화하는가?
• RQ3 집단 매개변수를 가진 단순한 동역학 모델이 스위치 동역학과 매개변수 민감도를 얼마나 정확하게 예측할 수 있는가?
• RQ4 DNA 및 효소 농도의 변동은 스위치 행동과 이중안정성에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ5 자기활성화 스위치는 합성 생화학 네트워크에서 신뢰할 수 있는 신호 반복기 또는 기억 요소로 기능할 수 있는가?

주요 결과

• 자기활성화 스위치는 초기 조건에 따라 명확한 이중안정성을 보이며, 고·저 RNA 출력 상태가 안정적으로 유지된다. 이는 젤 전기영동과 형광 측정으로 확인되었다.
• RNase H는 이중안정성에 필수적이며, 활성화제 rA가 형성한 RNA-DNA 하이브리드를 절단하여 피드백 루프 작동을 가능하게 한다.
• RNase R은 불완전한 전사 산물을 분해하여 잡음 없는 활성화를 보장하고, 신호 정확성을 확보한다.
• 베이지안 추론를 통해 50개의 실험 데이터 포인트에 적합화된 동역학 모델은 시간에 따른 동역학과 매개변수 민감도를 합리적인 정확도로 성공적으로 예측하였다.
• 모델의 매개변수에 대한 95% 신뢰구간은 620,000회 MCMC 반복 후 51개의 샘플링된 매개변수 세트로부터 유도되었으며, 예측의 강건성을 확인하였다.
• 스위치 행동은 구성 요소의 농도 조절이 가능하며, 결합 도메인 설계와 독립적으로 스위칭 임계값과 출력 수준을 조절할 수 있다.