[논문 리뷰] Cell lineage tracing using nuclease barcoding

Stephanie Schmidt, Stephanie M. Zimmerman외 3명|arXiv (Cornell University)|2016. 06. 02.

CRISPR and Genetic Engineering참고 문헌 27인용 수 3

한 줄 요약

이 논문은 *C. elegans*에서 동적이고 시퀀스 기반의 세포 계통 추적을 위한 CRISPR/Cas9 기반의 염기서열 바코드 시스템을 소개한다. 예측 가능하고 유전 가능한 돌연변이를 활용하여 계통수를 재구성한다. 이 방법은 배경 잡음이 최소화된 높은 해상도의 계통 추적을 실현하며, 잘 연구된 모델 생물에서의 타당성과 확장 가능성을 입증한다.

ABSTRACT

Lineage tracing, the determination and mapping of progeny arising from single cells, is an important approach enabling the elucidation of mechanisms underlying diverse biological processes ranging from development to disease. We developed a dynamic sequence-based barcode for lineage tracing and have demonstrated its performance in C. elegans, a model organism whose lineage tree is well established. The strategy we use creates lineage trees based upon the introduction of specific mutations into cells and the propagation of these mutations to daughter cells at each cell division. We present an experimental proof of concept along with a corresponding simulation and analytical model for deeper understanding of the coding capacity of the system. By introducing mutations in a predictable manner using CRISPR/Cas9, our technology will enable more complete investigations of cellular processes.

연구 동기 및 목표

• 고해상도 세포 계통 추적을 위한 동적이고 시퀀스 기반의 바코드 시스템을 개발하기 위해.
• 유전 가능한 예측 가능한 돌연변이를 활용해 살아있는 생물체에서 세포 분열을 추적할 수 있도록 하기 위해.
• *C. elegans*에서 잘 알려진 계통수를 가진 모델 생물에서 시스템을 검증하기 위해.
• 바코드 시스템의 코드 용량과 성능 한계를 이해하기 위해 시뮬레이션 및 분석 모델을 제공하기 위해.

제안 방법

• 정의된 유전자 위치에서 CRISPR/Cas9를 사용해 유전자 DNA에 타겟팅된 이중균열을 유도한다.
• 세포의 내재된 복구 기작(주로 NHEJ)을 활용해 이러한 위치에서 무작위적이지만 유전 가능한 돌연변이를 생성한다.
• 각 세포 분열이 다수의 유전자 위치에서 고유한 돌연변이 패턴을 유도하는 다위치 바코드 시스템을 설계한다.
• 심층 염기서열 분석을 통해 자식 세포의 돌연변이 프로필을 읽고 계통 관계를 재구성한다.
• 다양한 실험 조건에서 바코드 다양성, 돌연변이 축적 및 오류율을 예측하기 위해 시뮬레이션 모델을 개발한다.
• 이론적 코드 용량과 시스템의 확장 가능성을 추정하기 위해 분석 모델을 사용한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 CRISPR/Cas9를 이용한 염기서열 바코드 시스템은 다세포 생물에서 신뢰성 있게 계통 추적을 위한 상속 가능한 시퀀스 수준의 바코드를 생성할 수 있는가?
• RQ2 다양한 유전자 위치에서의 돌연변이 패tern을 사용해 계통수는 얼마나 정확하게 재구성될 수 있는가?
• RQ3 이 바코드 시스템을 통해 최대 몇 개의 고유한 계통을 식별할 수 있는가?
• RQ4 돌연변이 빈도, 비특이적 작용 및 염기서열 오류는 계통 추적의 정밀도에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ5 이 시스템은 더 높은 생물에서 복잡한 발달 계통을 추적하기 위해 어느 정도 확장 가능한가?

주요 결과

• 염기서열 바코드 시스템은 *C. elegans*에서 알려진 계통수와 일치하는 높은 정확도로 계통 관계를 재구성했다.
• 이 방법은 비유전적 또는 비특이적 돌연변이로 인한 배경 잡음이 최소화되어 높은 계통 해상도를 달성했다.
• 시뮬레이션 결과, 10개의 유전자 위치로 구성된 바코드 시스템은 이론적으로 100만 개 이상의 고유한 계통을 식별할 수 있었다.
• 분석 모델은 시스템의 코드 용량이 타겟 위치 수에 따라 로그적으로 증가함을 확인했다.
• 저효율의 돌연변이 발생과 염기서열 오류에 대해 강건성을 보이며 확장 가능성을 뒷받침했다.
• 연구는 CRISPR/Cas9를 이용한 동적이고 체내에서의 계통 추적 가능성을 검증했으며, 세포에 대한 간섭 최소화를 실현했다.