[논문 리뷰] CLEAR: Coverage-based Limiting-cell Experiment Analysis for RNA-seq

Logan A. Walker, Michael G. Sovic외 9명|arXiv (Cornell University)|2018. 06. 08.

Single-cell and spatial transcriptomics참고 문헌 70인용 수 3

한 줄 요약

CLEAR는 커버리지 기반 필터링을 통해 노이즈를 감소시켜 저입력 RNA-seq(lcRNA-seq) 데이터에서 신뢰할 수 있는 정량화 가능한 전사량을 식별하는 계산 워크플로우이다. 이는 다양한 입력량에서 전사량 일관성을 높이고, 주성분 분석(PCA)에서의 분리도 향상시키며, 세포 유형 간에 더 많은 차별 발현 유전자(DEG)를 식별함으로써 후속 차등 발현 분석을 향상시킨다.

ABSTRACT

Direct cDNA preamplification protocols developed for single-cell RNA-seq have enabled transcriptome profiling of precious clinical samples and rare cells without sample pooling or RNA extraction. Currently, there is no algorithm optimized to reveal and remove noisy transcripts in limiting-cell RNA-seq (lcRNA-seq) data for downstream analyses. Herein, we present CLEAR, a workflow that identifies reliably quantifiable transcripts in lcRNA-seq data for differentially expressed gene (DEG) analysis. Libraries at three input amounts of FACS-derived CD5+ and CD5- cells from a chronic lymphocytic leukemia patient were used to develop CLEAR. When using CLEAR transcripts vs. using all transcripts, downstream analyses revealed more shared transcripts across different input RNA amounts, improved Principal Component Analysis (PCA) separation, and yielded more DEGs between cell types. As proof-of-principle, CLEAR was applied to an in-house lcRNA-seq dataset and two public datasets. When imputation is used, CLEAR is also adaptable to large clinical studies and for single cell analyses.

연구 동기 및 목표

• 제한된 세포에서의 노이즈 전사량을 체계적으로 식별하고 제거하기 위한 전용 알고리즘이 부족한 문제를 해결한다.
• 저입력 RNA-seq 실험에서 후속 차등 발현 분석의 신뢰성과 재현성을 향상시킨다.
• 귀중한 임상 및 희귀 세포 샘플에서 다양한 RNA 입력량에 걸쳐 강력한 전사량 정량을 가능하게 한다.
• 확장성을 확보하기 위해 보정 방법과의 통합을 지원한다.
• 커버리지 패턴을 활용하여 lcRNA-seq 데이터에서 신뢰할 수 있는 정량화 가능한 전사량을 식별하는 표준화된 워크플로우를 제공한다.

제안 방법

• 복제체 간 일관되고 신뢰할 수 있는 신호를 보이는 전사량을 식별하기 위해 시퀀싱 리드의 커버리지 깊이를 활용한다.
• 낮거나 일관되지 않은 리드 커버리지로 인한 기술적 노이즈를 나타내는 전사량을 제거하기 위해 커버리지 기반 필터링 임계값을 적용한다.
• 생물학적 복제체 간 커버리지 분포를 기반으로 전사량 탐지 가능성에 대한 통계적 프레임워크를 구축한다.
• 고신뢰도 전사량을 분석에 우선순위를 두기 위해 후속 차등 발현 파ipeline와 통합한다.
• 세 가지 다른 입력량에서 만성 림프성 백혈병 홂환자의 FACS 분리된 CD5+ 및 CD5- 세포를 대상으로 검증하였다.
• 확장 가능한 대규모 임상 및 단세포 RNA-seq 데이터셋에 적용 가능하도록 보정 방법과 호환되도록 설계되었다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 저입력 RNA-seq 데이터에서 노이즈 전사량을 체계적으로 식별하고 필터링하여 데이터 품질을 향상시킬 수 있는 방법은 무엇인가?
• RQ2 커버리지 기반 필터링이 lcRNA-seq에서 다양한 RNA 입력량 간 전사량 일관성에 얼마나 기여하는가?
• RQ3 낮은 커버리지 전사량을 필터링하면 주성분 분석(PCA)에서 세포 유형 간 분리가 향상되는가?
• RQ4 필터링된 전사량을 사용할 경우 세포 유형 간에 식별되는 차등 발현 유전자(DEG)의 수와 신뢰성은 어떻게 변화하는가?
• RQ5 보정 방법과 결합할 경우 CLEAR 워크플로우는 대규모 임상 및 단세포 RNA-seq 연구에 효과적으로 적용될 수 있는가?

주요 결과

• 모든 전사량을 사용한 경우에 비해 CLEAR는 다양한 RNA 입력량 간 공통 전사량을 더 많이 식별하여 재현성 향상을 보였다.
• CLEAR 필터링 전사량을 사용한 PCA 분석에서 CD5+ 및 CD5- 세포 집단 간 더 명확한 분리가 관찰되어 노이즈 감소와 더 나은 생물학적 신호를 시사했다.
• CLEAR를 사용한 후속 차등 발현 분석은 모든 전사량을 사용한 분석에 비해 세포 유형 간 더 많은 차등 발현 유전자를 도출하였다.
• 세 가지 입력 수준의 FACS 분리 세포에서 CLEAR 워크플로우가 우수한 성능을 유지하여 저입력 실험 설계에서의 유용성을 확인했다.
• CLEAR는 보정 방법과 호환되어 대규모 임상 데이터셋 및 단세포 RNA-seq 응용 분야에 적용 가능함을 입증했다.
• 불일치하거나 낮은 커버리지 전사량을 필터링하여 기술적 노이즈를 효과적으로 감소시켜 후속 분석의 데이터 신뢰도를 향상시켰다.