[논문 리뷰] Clustering pipeline for determining consensus sequences in targeted next-generation sequencing

Raunaq Malhotra, Daniel Elleder외 4명|arXiv (Cornell University)|2014. 10. 07.

Genomics and Phylogenetic Studies참고 문헌 25인용 수 5

한 줄 요약

이 논문은 이동 요소 통합 부위를 위한 표적 NGS 데이터에서 공통 시퀀스 복구를 향상시키기 위해 UCLUST와 최적화된 I-index 측정법을 사용하는 다중 라운드 클러스터링 파이프라인을 제안한다. 반복적으로 클러스터링 임계값을 조정함으로써, 단일 라운드 클러스터링에 비해 진짜 통합 부위를 더 정확하게 식별하는 데 성공하였으며, 특히 반복적 요소가 풍부한 영역에서 뛰어난 성능을 보였다. 이는 다양한 시퀀싱 깊이에서도 안정적인 성능을 유지한다.

ABSTRACT

Analyses of targeted genomic sequencing data from next-generation-sequencing (NGS) technologies typically involves mapping reads to a reference sequence or clustering reads. For a number of species a reference genome is not available so the analyses of targeted sequencing data, for example polymorphic structural variation caused by mobile elements is difficult; clustering methods are preferred for such data analysis. Clustering of reads requires a clustering threshold parameter, which is used to compare and group reads. However, determining the optimal clustering threshold for a read dataset is challenging because of different sequence composition, the number of sequences present, and also the amount of sequencing errors in the dataset. High values of the clustering threshold parameter can falsely inflate the number of recovered genomic regions, while low values of clustering threshold can merge reads from distinct regions into a single cluster. Thus, an algorithm that can empirically determine clustering threshold is needed. We propose a pipeline for clustering genomic sequences wherein the clustering threshold is empirically determined from the NGS data. The optimal threshold is decided based on two internal clustering measures which assess clusters for small intra-cluster diameters and large inter-cluster distances. We evaluate the pipeline on two simulated datasets derived from human genome sequence simulating different genomic regions and sequencing depth. The total number of clusters obtained from our pipeline is closer to the actual number of reference sequences when compared to single round of clustering. Also, the number of clusters whose consensus sequence matches a corresponding reference sequence is higher in our pipeline. We observe that the presence of repeat regions affects clustering accuracy.

연구 동기 및 목표

• 기본 게놈이 없거나 불완전할 경우 집단 내 이동 요소 통합 부위를 정확하게 식별하는 데 도전하는 데 목적을 두며.
• 기본적으로 과다 또는 과소 보고를 유도하는 클러스터링 임계값을 최적화함으로써 NGS 데이터에서 클러스터링 정확도를 향상시키는 데 목적을 두며.
• 내부 클러스터링 측정법(I-index)을 사용하여 클러스터의 응집도와 분리도를 향상시켜 시퀀싱 노이즈와 다형성으로 인한 오류를 줄이는 파이프라인을 개발하는 데 목적을 두며.
• 시퀀싱 깊이의 변동성과 게놈적 맥락(예: 반복 영역 대 유일 영역)이 클러스터링 성능에 미치는 영향을 평가하는 데 목적을 두며.

제안 방법

• 파이프라인은 쌍별 시퀀스 유사도 기반으로 NGS 리드를 초기 클러스터링하기 위해 UCLUST를 사용하며, 클러스터 형성에 영향을 주는 클러스터링 임계값 θ를 제어한다.
• 다중 라운드 클러스터링 접근법을 적용하여 I-index를 최대화하는 데 목적이 있는 여러 임계값 쌍(θ¹, θ³)을 테스트함으로써 최적의 조합을 식별한다.
• I-index는 클러스터 응집도와 상호 클러스터 간 분리도를 종합한 측정법으로, Dunn 및 Davies-Bouldin 지표에서 유도되며, 임계값 선택을 안내한다.
• PCR 유도 오류를 줄이고 정렬 일관성을 향상시키기 위해 리드를 프리프로세싱하여 프라이머 서열을 제거하고 일정 길이로 컷팅한다.
• 파이프라인은 내부(I-index) 및 외부(E-index) 측정법을 사용하여 클러스터링 성능을 평가하며, 결과를 단일 라운드 UCLUST 클러스터링과 비교한다.
• 최적의 임계값은 최대 I-index 값 기반으로 선택되며, 이는 최종 클러스터 및 공통 시퀀스 생성에 사용된다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 최적화된 임계값 선택을 통한 다중 라운드 클러스터링 파이프라인이 단일 라운드 클러스터링에 비해 이동 요소 통합 부위의 공통 시퀀스 복구 정확도를 향상시킬 수 있는가?
• RQ2 시퀀싱 깊이가 클러스터링 파이프라인의 진짜 통합 부위 시퀀스 복구 성능에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ3 유전체적 맥락—특히 반복 영역 대비 유일 영역—이 클러스터링 정확도에 어느 정도의 영향을 미치는가?
• RQ4 I-index는 클러스터 응집도와 분리도의 균형을 이루는 최적의 클러스터링 임계값 선택을 효과적으로 안내할 수 있는가?

주요 결과

• 제안된 파이프라인은 더 높은 I-index 및 E-index 값을 기록함으로써 단일 라운드 UCLUST 클러스터링에 비해 더 나은 클러스터 응집도와 분리도를 보였다.
• 최적의 임계값에서, 시퀀싱 깊이에 관계없이 시뮬레이션 데이터셋에서 실제 통합 부위 수의 94~98%를 회복하였다.
• 유일 영역 통합 부위의 경우, 84%의 클러스터가 진짜 공통 시퀀스와 1 염기 이내에 위치했으며, 반복 영역 부위의 경우 이는 55% 미만이었다.
• 반복 서열의 존재는 클러스터링 정확도를 크게 떨어뜨리며, 이는 유사한 서열으로 인해 더 많은 융합이 발생하기 때문이다.
• 파이프라인은 시퀀싱 깊이에 대해 강건하며, 커버리지가 9배 이상 다른 데이터셋 간 성능 저하가 없었다.
• 최적의 클러스터링 임계값 쌍은 서열 콘텐츠, 특히 반복 요소의 존재에 따라 달라지며, 이는 콘텐츠 인식 기반의 임계값 선택이 필요함을 시사한다.