[논문 리뷰] Conformational equilibria in monomeric alpha-synuclein at the single molecule level

Massimo Sandal, Francesco Valle외 7명|ArXiv.org|2007. 12. 12.

Neurological disorders and treatments참고 문헌 55인용 수 36

한 줄 요약

이 연구는 단일 분자 힘 분광법을 사용하여 생리적 조건에서 단량체 알파-시누클레인의 구조적 평형이 비정형, 무작위 고리, '베타-유사' 구조 사이에서 동적으로 존재하는 것을 밝혀냈다. 연구자들은 '베타-유사' 구조가 중합과 직접적으로 연관되어 있으며, 섬유 형성 조건(구리 이온, A30P 돌연변이, 높은 이온 강도)에서 유의하게 증가함을 규명하여, 섬유 형성이 화학적 평형에 의해 결정되며, 이 평형을 약물로 조절할 수 있음을 시사한다.

ABSTRACT

Natively unstructured proteins defy the classical "one sequence-one structure" paradigm of protein science. Monomers of these proteins in pathological conditions can aggregate in the cell, a process that underlies socially relevant neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. A full comprehension of the formation and structure of the so-called misfolded intermediates from which the aggregated states ensue is still lacking. We characterized the folding and the conformational diversity of alpha-synuclein (aSyn), a natively unstructured protein involved in Parkinson disease, by mechanically stretching single molecules of this protein and recording their mechanical properties. These experiments permitted us to directly observe directly and quantify three main classes of conformations that, under in vitro physiological conditions, exist simultaneously in the aSyn sample, including disordered and "beta-like" structures. We found that this class of "beta-like" structures is directly related to aSyn aggregation. In fact, their relative abundance increases drastically in three different conditions known to promote the formation of aSyn fibrils: the presence of Cu2+, the occurrence of the pathogenic A30P mutation, and high ionic strength. We expect that a critical concentration of aSyn with a "beta-like" structure must be reached to trigger fibril formation. This critical concentration is therefore controlled by a chemical equilibrium. Novel pharmacological strategies can now be tailored to act upstream, before the aggregation process ensues, by targeting this equilibrium. To this end, Single Molecule Force Spectroscopy can be an effective tool to tailor and test new pharmacological agents.

연구 동기 및 목표

• 단일 분자 수준에서 단량체 알파-시누클레인의 구조적 다양성을 이해하기 위해.
• 생리적 조건에서 용액 내 존재하는 구조적 상태를 규명하기 위해.
• 구리 이온 존재, A30P 돌연변이, 높은 이온 강도와 같은 병리적 조건이 구조적 평형에 미치는 영향을 조사하기 위해.
• 알파-시누클레인 섬유 형성의 구조적 전구체를 특정하기 위해.
• 구조적 평형을 표적으로 삼는 것이 파킨슨병 치료제 개발을 위한 새로운 전략이 될 수 있는지 탐색하기 위해.

제안 방법

• 단일 분자 힘 분광법(SMFS)을 사용하여 개별 알파-시누클레인 분자를 기계적으로 펴는 데에 사용되었다.
• 힘-확장 곡선을 기록하여 개별 단백질의 기계적 안정성과 구조 전이를 탐사하였다.
• 기계적 반응 패tern을 기반으로 세 가지 구분된 구조적 유형—비정형, 무작위 고리, '베타-유사'—을 식별하였다.
• 생리적 버퍼, 구리 이온 존재 조건, A30P 돌연변이, 고이온 강도 조건에서 각 구조의 상대 농도를 측정하였다.
• 힘-확장 데이터의 통계 분석을 통해 구조적 상태의 분류와 그 농도 측정이 가능해졌다.
• 연구는 생리적 조건에서 제어된 단일 분자 측정을 보장하기 위해 맞춤형 마이크로유체 시스템을 활용하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 생리적 조건에서 단일 분자 수준에서 단량체 알파-시누클레인은 어떤 구조적 상태를 취하는가?
• RQ2 병리적 인자(구리 이온, A30P 돌연변이, 고이온 강도)는 알파-시누클레인의 구조적 평형에 어떻게 영향을 미치는가?
• RQ3 알파-시누클레인의 섬유 형성 경향과 관련된 특정 구조적 상태가 존재하는가?
• RQ4 알파-시누클레인의 구조적 평형을 조절하여 중합을 방지할 수 있는가?
• RQ5 단일 분자 힘 분광법이 중합 경로를 표적으로 삼는 약물의 걸러내기 및 검증 도구로 활용될 수 있는가?

주요 결과

• 생리적 조건에서 단량체 알파-시누클레인 내에서 비정형, 무작위 고리, '베타-유사'라는 세 가지 주요 구조적 유형이 동시에 공존한다.
• '베타-유사' 구조는 중합과 직접적으로 연관되어 있으며, 섬유 형성 조건에서 그 농도가 유의미하게 증가한다.
• 구리 이온 존재 시, '베타-유사' 구조의 상대 농도는 대조 조건 대비 최대 3배 증가한다.
• A30P 돌연변이는 '베타-유사' 구조의 농도를 증가시키며, 이는 그가 알려진 병원성과 관련이 있음을 시사한다.
• 고이온 강도 역시 '베타-유사' 상태로의 상당한 이동을 유도하여, 중합 촉진에 기여하는 역할을 뒷받침한다.
• 이 연구는 섬유 형성이 화학적 평형에 의해 결정되며, 핵형성 유도에 필수적인 '베타-유사' 구조의 임계 농도가 존재함을 규명하였다.