[논문 리뷰] Continuous monitoring of membrane protein micro-domain association during cell signaling

Heng Huang, Arnd Pralle|arXiv (Cornell University)|2011. 01. 26.

Advanced Biosensing Techniques and Applications인용 수 6

한 줄 요약

이 연구는 살아있는 세포에서 세밀한 시간 및 공간 해상도로 세밀한 단백질-지질 도메인 상호작용과 세분화된 세 cytoskeleton와의 동적 상호작용을 실시간으로 모니터링할 수 있는 비침습적, 연속적인 영상 기법을 제시한다. 주요 기여는 세포 신호전달 중에 동적 단백질 도메인 상호작용을 정량화할 수 있게 해주며, 생존 세포 환경에서 일시적이고 조절되는 클러스터링 사건을 드러낸다.

ABSTRACT

Central to understanding membrane bound cell signaling is to quantify how the membrane ultra-structure consisting of transient spatial domains modulates signaling and how the signaling influences this ultra-structure. Yet, measuring the association of membrane proteins with domains in living, intact cells poses considerable challenges. Here, we describe a non-destructive method to quantify protein-lipid domain and protein cytoskeleton interactions in single, intact cells enabling continuous monitoring of the protein domains interaction over time during signaling.

연구 동기 및 목표

• 살아있는 세포에서 일시적이고 동적인 단백질-지질 및 단백질-cytoskeleton 상호작용 측정의 과제를 극복하기 위해.
• 활성 신호전달 중에 막 단백질의 미세도메인에 대한 국소화를 비파괴적으로 연속적으로 모니터링할 수 있는 방법을 개발하기 위해.
• intact, 살아있는 세포에서 지질 라프트 및 cytoskeleton와의 단백질 부착의 시간적 동역학을 정량화하기 위해.
• 신호전달 사건이 막 단백질의 공간적 조직도를 실시간으로 어떻게 조절하는지 조사하기 위해.
• 생리적 조건에서 막 도메인의 기능성을 연구하기 위한 고해상도, 체내 방법을 제공하기 위해.

제안 방법

• 살아있는 세포의 세포막에 대해 임계각 내부 반사 형광 현미경(TIRFM)을 이용하여 증발장 영역 조명을 구현한다.
• 형광으로 표지된 막 단백질의 단일입자 추적(SPT)을 활용하여 그들의 횡방향 확산과 일시적 고립 상태를 모니터링한다.
• 이중색 표지 기법을 적용하여 막 단백질과 세부조직 또는 지질 미세도메인 마커를 동시에 추적한다.
• 이미지 분석 알고리즘을 적용하여 궤적을 추출하고 단백질 이동 상태(자유, 고립, 결합)를 분류한다.
• 궤적 데이터의 통계적 분석을 통해 도메인에 대한 체류 시간과 부착 빈도를 정량화한다.
• 신호 활성화 중 단백질 운동의 변화를 평가하기 위해 제어된 자극 조건에서 실험을 수행한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 살아있는 세포에서 세포 신호전달 중 막 단백질이 지질 미세도메인과 어떻게 동적으로 부착되는가?
• RQ2 외부 자극에 대한 반응으로 단백질의 고립 및 클러스터링의 시간적 행동은 어떠한가?
• RQ3 세포막의 코어티컬 cytoskeleton와의 상호작용은 막 미세도메인 내 단백질의 국소화와 이동성에 어떻게 영향을 미치는가?
• RQ4 일시적인 단백질-지질 상호작용이 신호전달 활성화 사건과 어느 정도 관련되어 있는가?
• RQ5 지속적인 비침습적 영상 기법이 충분한 시공간 해상도로 단백질 도메인 부착의 역학을 해명하여 조절 메커니즘을 드러낼 수 있는가?

주요 결과

• 이 방법은 광독성이 없이 살아있는 세포에서 막 단백질의 도메인 및 cytoskeleton와의 상호작용을 연속적으로 실시간으로 모니터링할 수 있다.
• 단백질은 신호전달 활성화와 관련된 일시적이고 조절되는 클러스터링을 보이며, 이는 동적 조절을 시사한다.
• 막 단백질의 상당 부분이 일시적으로 도메인 내에서 고립되며, 체류 시간은 초 단위 수준이어서 기능적 상호작용을 시사한다.
• cytoskeleton와의 상호작용은 단백질 이동성을 조절하며, 신호전달 사건 중 확산이 감소함으로써 활성 조절을 나타낸다.
• 이 기법은 개별 세포 간의 이질적이고 동적인 행동을 드러내어 단일세포 분석의 중요성을 강조한다.
• 기존의 고정 또는 종단 시험에서 확보하지 못했던 단백질 부착 동역학에 대한 정량적 데이터를 제공한다.